Este protocolo describe un método de recubrimiento para restringir el crecimiento de células endoteliales a una región específica de una placa de 6 pozos para la aplicación de estrés pura utilizando el modelo de agitador orbital. Una forma común de estudiar los efectos del flujo sobre el endotelio es cultivar células endoteliales en placas de cultivo de múltiples pozos en un agitador orbital. La coctelera orbital induce una onda que gira alrededor del pozo.
Las células en el centro del pozo experimentan la clase de flujos que se piensan para llevar a la ateroesclerosis. Las células más cercanas al borde experimentan un flujo que se cree que es protector. Se supone que las propiedades de las células en cada región dependen de las tensiones que experimentan.
Sin embargo, hay un piso potencial en esta lógica. Las células endoteliales liberan mediadores de forma dependiente del flujo. Estos mediadores alcanzarán una concentración uniforme en el medio arremolinado y, por lo tanto, afectarán a las células en regiones distintas de aquella en la que fueron liberadas.
Eso puede corromper u ocultar los verdaderos efectos de la cizalladura en el comportamiento celular. El efecto no se limita al sistema de pozos girando. Puede ocurrir incluso en modelos simples, como la cámara de flujo de placa paralela.
Se puede evitar mediante el cultivo de células en una sola parte del sistema. Aquí, describimos métodos para permitir la adhesión celular sólo en el centro o sólo en el borde del pozo arremolinado. Fabricación de módulo de acero inoxidable.
Fabrique el módulo de acero inoxidable de un acero inoxidable de grado 316 de acuerdo con un dibujo de ingeniería proporcionado. Impresión 3D en PDP. Prepare un modelo CAD 3D de molde de PDMs utilizando SOLIDWORKS de acuerdo con el dibujo de ingeniería proporcionado.
Exporte el modelo CAD a un archivo STL e importe el archivo STL en Cura 2.6.2. Divida el modelo en capas con una velocidad de impresión de 50 milímetros por segundo y una densidad de relleno del 60% Exporte el archivo como un GCode. Lo subió a una impresora 3D Ultimaker para imprimir.
Utilice ácido poliláctico como material de impresión. Fundición del anillo PDMS. Mezcle bien la base de PDMS y el agente de curado con la proporción de 90.9% base y 9.1% agente de curado.
Vierta la solución bien mezclada en el molde impreso en 3D. Retire las burbujas en una cámara de desgasificación al vacío. Curarlo durante una hora en un horno de 80 grados.
Deje que el anillo PDMS se enfríe a temperatura ambiente. A continuación, retire el anillo PDMS curado cuidadosamente del molde. Preparación del 1%Pluronic F-127.
Pesa cinco gramos de Pluronic F-127. Vierta en una botella de vidrio. Luego agregue cien mil de agua Milli-Q en la botella de vidrio.
Esto da una solución 5%Pluronic F-127. Asegúrese de que todo el polvo Pluronic F-127 esté sumergido en el agua. Cierre la tapa y autoclave usando un programa de ciclo de esterilización líquida.
Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de su uso. Agregue 10 mil de solución 5% Pluronic F-127 a 40 mil de agua Milli-Q en autoclave para hacer una solución 1% Pluronic F-127. Realice la dilución en una campana del gabinete de bioseguridad.
Guarde tanto 1% como 5% Pluronic F-127 a temperatura ambiente. Recubrimiento de placa de 6 pozos. Módulo de acero inoxidable en autoclave, anillo PDMS y pinzas antes de su uso.
Realice todos los procedimientos subsecuentes en una capilla de BSC y observe técnicas asépticas para asegurar esterilidad. Coloque el anillo PDMS en un pozo de 6 pozos con pinzas. Utilice el borde externo del anillo PDMS para alinear el anillo PDMS de forma concéntrica dentro del pozo.
Tenga en cuenta que solo se deben usar placas de pozos no tratadas con tejidos. Coloque el módulo de acero inoxidable en la parte superior del anillo PDMS usando pinzas. Inserte las puntas de los alicates internos del anillo de retención en las bodegas de agarre del anillo de retención.
Apriete el soporte para reducir el diámetro del anillo de retención. Colómelo en el pozo de 6, presione firmemente en el módulo de acero inoxidable y suelte los alicates para asegurar el anillo PDMS en el pozo. Agregue una mil de cinco microgramos por microlitro de fibronectina en el centro o el borde del pozo, dependiendo de la región de interés, a través de la apertura del anillo PDMS y el módulo de acero inoxidable.
Gire la placa para asegurarse de que la solución de fibronectina cubra toda la región de interés. Incubar durante 30 minutos a 37 grados en una incubadora humidificada bajo 95% de aire y 5% de CO2. Retire la solución de fibronectina del pozo.
Y ahora lavar dos veces con PBS. Una vez hecho esto, retire completamente el PBS del pozo. Retire el anillo de retención, el módulo de acero inoxidable y el anillo PDMS del pozo.
Agregue 1.5 mil de 1% Pluronic F-127 en el pozo e incube durante una hora a temperatura ambiente para pasivar la superficie sin recubrimiento. Retire la solución Pluronic F-127 del pozo y lave tres veces con PBS. Una vez lavado, use el pozo recubierto inmediatamente o guárdelo a cuatro grados durante un hasta dos semanas con la capa de PBS en el pozo recubierto.
Siembra de células endoteliales. Cuente las células usando un hemocytometer y la semilla 180, 000 células en una placa revestida 6-well en 1,5 mil del medio de cultivo celular pre-caliente. Agite la placa del pozo lateralmente para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente en el pozo.
Déjelo en una incubadora humidificada de 37 grados bajo un 95% de aire y un 5% de CO2 durante la noche. Aplicación de esfuerzo de cizalladura utilizando un agitador orbital. Las células deben alcanzar la confluencia después de tres días de crecimiento.
Reemplace el medio con 1.9 mil de medio de cultivo celular de pre-advertencia para lograr una altura de dos milímetros. Coloque una placa de pozo en la plataforma de una coctelera orbital en una incubadora humidificada y gire a 150 RPM durante tres días. Opcional, después de dos días de cizallamiento, las citoquinas se pueden agregar al medio de cultivo celular para investigar la interacción entre las citoquinas y el estrés.
Después del tratamiento, cizalla las células para otro día. En este estudio, la TNF-alfa fue utilizada para activar las células. Realice el análisis después de tres días de aplicación de la tensión del esquilo.
Las imágenes del microscopio demuestran que Pluronic F-127 previno la adherencia de HUVEC a la región sin la capa del fibronectin. No se adjuntó NINGÚN HUVECs a la parte de la superficie del pozo que no había sido pretratada con fibronectina antes de la pasivación del Pluronic F-127 después de 24 horas, en la figura A, y 72 horas, en la figura C, de crecimiento. Sin la pasivación Pluronic F-127, los HUVECs se unieron a la superficie sin fibronectina, 24 horas después de la siembra, en la figura B, y proliferan aún más en 72 horas, en la figura D.La barra de escala es igual a 500 micrómetros.
La mancha roja nuclear muestra la morfología de huvecs cizallados, A, en el centro, y B, en el borde de un pozo lleno. La barra de escala es igual a cien micrómetros. A y B también muestran contornos celulares delineados por inmunostaining de ZO-1.
Tenga en cuenta la alineación y elongación de las celdas en el borde, pero no en el centro. No muestra ninguna diferencia significativa en el índice de forma nuclear, lo que indica redodez, entre los HUVECs crecidos en pleno pozo y los pozos segmentados se observaron para huvecs no tratados o TNF-alfa-tratados. Las células eran más alargadas cerca del borde del pozo.
Una tendencia para un mayor alargamiento en HUVECs TNF-alfa-tratado no era constantemente significativa a través de localizaciones. No se observó ninguna diferencia significativa entre los pozos llenos y segmentados en número de la densidad de A, no tratado, y de B, TNF-alfa-tratado HUVECs en diversas localizaciones radiales. En ambos casos, había más celdas por unidad de área en el borde que en el centro del pozo.
En conclusión, el método que hemos descrito aquí le permite cultivar células en una sola región del pozo de remolino o, de hecho, de cualquier sistema de cultivo celular a base de plástico. Eso significa que las células en una parte del pozo que experimentan un tipo de flujo no están influenciadas por mediadores liberados de células en otra región que experimentan diferentes flujos. No solo eso, podemos observar las células cultivadas en una región con o sin células que se cultivan en otras regiones.
Eso permite demostrar los efectos de tales mediadores solubles. Probar los efectos del medio condicionado en células ingenuas permite lo mismo. Mediante el análisis del medio de condición, los mediadores pueden ser identificados.
