Este modelo de cáncer microfluídico en chip que llamamos acelerador de evolución, proporciona una plataforma controlable para estudios cuantitativos a largo plazo y en tiempo real de la dinámica del cáncer dentro de condiciones ambientales bien definidas a un nivel de célula única. La tecnología nos permite sondear la dinámica evolutiva del cáncer bajo un paisaje de estrés similar a un tumor. Proporcionar información que incluye morfología, población, motilidad y migración a lo largo del tiempo a nivel celular.
Con la capacidad de controlar y monitorear el comportamiento de las poblaciones de tumores mixtos bajo gradientes de estrés bien controlados, nuestra tecnología puede presentar un modelo más relevante fisiológicamente para el desarrollo de fármacos preclínicos. El método de envasado de sellado a presión presentado también se puede implementar en otros sistemas microfluídicos que requieren un ajuste sofisticado de la composición del gas ambiental, así como la capacidad de experimento aguas abajo. Las claves para realizar con éxito un experimento a largo plazo es asegurar un entorno estable física y bioquímicamente.
Los factores, como la temperatura, la humedad y la composición del gas, deben controlarse en todo momento. Para empezar, fabrique un soporte de placa que sea suficiente para mantener platos de cultivo permeables al gas simultáneos en una máquina de impresión 3D. Desenrosque los componentes de la placa de muestra personalizada de tres pozos con destornillador.
Desinfectar los componentes a través de la exposición UV durante al menos una hora y dejar en un ambiente estéril. Para iniciar la siembra de líneas celulares, agregue cinco mililitros de tripina en cada cultivo celular PC3-Epi o PC3-EMT en un plato de cultivo de 10 centímetros y ejecute la tripsinación durante cinco minutos en una incubadora a 37 grados centígrados. Transfiera las células de los platos de cultivo en tubos centrífugos de 15 mililitros y luego centrifugar a 150 veces g durante tres minutos.
Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender cada uno de los gránulos celulares en los tubos de centrífuga de 15 mililitros y cuente las células de cada PC3-MP o PC3-EMT utilizando un hemocitociómetro. Aísle un total de 2,5 veces 10 a los cuatro de cada tipo de celda.
Mezcle los dos tipos de celdas aisladas y agregue dos mililitros de medios de cultivo. Semilla de dos mililitros del cultivo celular en cada uno de los tres platos de cultivo permeables al gas. Deje el gas permeable en la incubadora a 37 grados centígrados durante la noche para que las células se adhieran.
Desinfecte los dispositivos PDMS a través de la exposición UV durante al menos una hora y déjelo en un entorno estéril. Ahora configure un sistema de suministro de gas que consta de unidades de control de dióxido de carbono y oxígeno, una bomba de gas, una cámara de mezcla de gas, un humidificador o burbujeador, y tres conjuntos separados de válvulas de gas y manómetros. Alternativamente, utilice un sistema de suministro de gas que proporcione la condición de normoxia.
Asegúrese de que la humedad relativa en la cámara de mezcla se incrementa a más del 85%Configure una unidad de control térmico de incubación en el escenario a 37 grados centígrados con subunidades de calentamiento separadas para la tapa y la placa inferior. Al día siguiente saque los platos de cultivo permeables al gas de la incubadora e identifique que los componentes detallados están en orden, Cada pozo posee un porta platos de cultivo permeable al gas, un soporte de chip PDMS, un soporte de ventana de vidrio y un par de ventanas de vidrio de 35 mililitros de ancho. Utilice los tornillos instalados para ensamblar estos componentes y sujetar el plato de cultivo permeable al gas.
A continuación, transfiera el medio de cultivo precalentado a una cámara de vacío a desgasificado durante 20 minutos. Trate el chip PDMS en un sistema de plasma de oxígeno durante 30 segundos con el fin de mantener la hidrofilia. A continuación, cargue dos jeringas lentamente con 10 mililitros de medios de crecimiento desgastecidos y las otras dos jeringas con 10 mililitros de reactivo deseado desgaste.
Por ejemplo, medios y medios con medicamentos. Conecte cada jeringa individual a un tubo de 50 centímetros mediante una aguja dispensadora de calibre 23 en un pasador de acero hueco. Inserte un pasador de acero hueco en el otro extremo del tubo.
Empuje el soporte en el tubo para preparar el tubo e inserte el pasador de acero en cada chip PDMS a través de la capa de tapado. Llene la capa de depósito y moje la capa de patrón PDMS con medios. La capa de depósito funciona como trampa de burbujas en el chip para evitar que las burbujas de aire entren en el patrón microfluídico.
A continuación, cargue una jeringa de un mililitro con medios de cultivo. Conecte la jeringa a un tubo de cinco centímetros mediante una aguja dispensadora de calibre 23 en un pasador de acero hueco. Inserte un pasador de acero hueco en el otro extremo del tubo y prima el tubo.
Inserte el pasador de acero hueco en el orificio central de la viruta para que los medios excesivos se extraigan más tarde. Cargue dos jeringas de 10 mililitros por chip en la cubierta delantera y coloque las otras dos jeringas en la cubierta de retirada del sistema de jeringas. Con el fin de evitar atrapar microburbujas en el patrón microfluídico, dispensar un mililitro de los medios precaleados y desgasificados en el plato de cultivo permeable de gas profundo de 35 mililitros.
Coloque las virutas directamente sobre las membranas de cultivo permeables al gas, donde la viruta se acerca a la superficie líquida con un ángulo de inclinación de 15 grados. Sujete el chip PDMS con el soporte de chip PDMS, empujando el dispositivo PDMS hacia abajo. Pegue una hoja de un sellador en la parte superior del dispositivo PDMS y sujete con el soporte de chip PDMS, para evitar que el chip se seque.
Establezca el caudal de medios alrededor de la matriz para que sea de 20 microlitros por hora. Coloque toda la placa en la incubadora en el escenario en la etapa motorizada de un microscopio invertido. Conecte el sistema de suministro de gas a los canales de gas a través de tubos de gas y mantenga la presión del manómetro a 0,2 PSI.
Esto presuriza la membrana de cultivo permeable al gas contra el chip PDMS instalado para garantizar el sellado del dispositivo. Extraiga lentamente medios excesivos en el chip utilizando la jeringa de un mililitro del orificio central. Observe el chip bajo el microscopio mientras extrae los medios y luego deje de extraer cuando el chip esté sellado.
Conecte la unidad de detección de temperatura de la incubadora en el escenario a la placa de tres pozos y ajuste a 37 grados centígrados. En este estudio PC3 cultivado en un acelerador de evolución sin la presencia de tensión externa tenía curvas de crecimiento mientras estaba alineado. Sugiriendo la idéntica del perfil de proliferación celular en función de la posición a través del chip.
La pendiente inicial de las curvas revela la tasa de proliferación. El tiempo de duplicación de las celdas en el dispositivo es de alrededor de 24 horas. GFP que expresa PC3-EMT y mCherry expresando células PC3-Epi forradas fueron co-cultivadas en el acelerador de evolución.
A partir del 40% de confluencia, la cocultura creció un 40% de confluencia en tres días. Mientras que la curva de crecimiento de la confluencia total está en forma de modelo de crecimiento logístico. La población de PC3-EMT continuó expandiéndose y PC3-Epi fue suprimida en la fase asintomática.
Las células PC3-Epi y PC3-EMT estaban densamente asentadas en el centro del dispositivo y se les permitió migrar libremente hacia la región vacía. El histograma normalizado de la velocidad de la velocidad de ambos fenotipos muestra que la velocidad del PC3-EMT fue significativamente mayor que PC3-Epi por un factor de 1,8 veces. Es muy importante evitar la creación de microburbujas a toda costa, mientras que los medios de cultivo deben ser precalegados y desgasificados.
El chip PDMS debe humedecarse correctamente y manipularse suavemente. Debido a la naturaleza suave resellable de nuestro método de sellado a presión, muchos experimentos aguas abajo pueden ser preformados. Como la extracción de población subclínica, el análisis de metabolitos locales y la inmunofluorescencia y secuenciación resueltas espacialmente.
Nuestra tecnología demuestra una manera de reproducir componentes clave e interacciones en un entorno supermicro complejo de una manera integral. Sin embargo, lo suficientemente simple como para proporcionar datos cuantitativos, fiables y reproducibles.
