Agradecemos a Mike Vahey del Laboratorio Fletcher de la Universidad de California, Berkeley para el asesoramiento sobre los parámetros microjetting. Este trabajo fue patrocinado por el NIH subvención HL117748 DP2-01.

1. Cámara Infinito Fabrication <ol><li> Diseño de la cámara de infinito (llamado así por su forma) utilizando un software de diseño asistido por ordenador (CAD), y guarde el archivo de manera que sea compatible con un cortador láser. Para crear esta forma, separadas dos círculos de diámetro 0.183 en una distancia de centro a centro de 0,15 pulg Corte la cámara desde 1/8- 3/16 en acrílico transparente con el cortador láser. La forma del infinito facilita gota formación de bicapa interfaz y la estabilidad. </li><li> Taladre un 1/16 en el agujero en el borde de la cámara de acrílico al pozo en forma de infinito. Repita en el lado opuesto. Corte un pequeño rectángulo partir de una lámina de acrílico 0,2 mm con tijeras o un cortador láser para servir como un fondo para los pozos. </li><li> Aplicar una capa fina pero completa de adhesivo de secado rápido a un lado de la de acrílico 0,2 mm y pegamento a la parte inferior de la cámara. Mantenga el acrílico 0,2 mm firmemente en su lugar contra la parte inferior de la cámara y dispensarel pegamento en la superficie para permitir que el pegamento para crear un sello, sino evitar que cubre el área de visualización. Asegúrese de alinear el acrílico de forma que su borde quede al ras con el borde de la pared de la cámara y cubre por completo la cámara de corte infinito. Esto permitirá suficiente para la penetración del chorro y evitar la fuga del pozo. </li><li> Corte dos pedazos pequeños de caucho natural para cubrir los agujeros perforados. Aplique el pegamento de secado rápido alrededor del agujero. Coloque la goma sobre el agujero y presione en todas las áreas, con un par de pinzas para asegurar. Repita el procedimiento para los dos agujeros perforados. Asegúrese de que todas las conexiones están pegadas juntas completos a fin de evitar cualquier fuga. </li><li> El uso de un 23 G, 1 en la aguja, hacer un agujero en la goma natural en ambos lados de la cámara para facilitar la inserción de la punta de inyección de tinta piezoeléctrica. </li></ol> 2. Preparación Experimental Almacenar la solución de stock de lípidos en cloroformo en un -20 ° C congelador. Para este estudio, ya sea 1,2-diphytanose utilizó il-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC). 2 ml de 25 mg solución de lípidos / ml se prepara típicamente en este protocolo y se prolongará durante dos meses cuando se almacenan a -20 ° C. <ol><li> Para resuspender el lípido en n-decano, primero transferir desde un vial de stock a un pequeño frasco de vidrio, y suavemente seco en atmósfera de argón o nitrógeno. Mantenga el frasco en un ángulo durante el secado para exponer más área de superficie para el gas, permitiendo que el lípido se seque más rápido. </li><li> Con la tapa de la jarra sólo ligeramente enroscada, permita que la solución se secó para sentarse en vacío en un desecador durante 1-2 horas. A continuación, añadir n-decano a resolubilizar el lípido en 25 mg / ml. Vórtice brevemente la solución de lípidos y someter a ultrasonidos en un baño de ultrasonido durante 15 min. Guarde el lípido se reconstituye en n-decano a -20 ° C. </li><li> Preparar una solución madre de sacarosa. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 900 l de sacarosa 300 mM y 100 lde 1% de metilcelulosa (MC). La metilcelulosa se añade para aumentar la viscosidad de la solución, que ayuda en la inyección. Paso opcional: Añadir un opcional de 1 l de colorante alimentario de color oscuro o perlas fluorescentes para dar más contraste o fluorescencia en proyección de imagen, respectivamente. Esta solución es una solución de 300 mOsm sacarosa diseñado para que coincida con la osmolaridad celular y para proporcionar contraste durante microjetting. </li><li> Dibuje la solución en una desechable 1 ml jeringa de plástico. Mientras sostiene la jeringa con la punta hacia arriba, encender el eje varias veces para expulsar las burbujas hacia la punta, y empuje el émbolo para expulsar el aire atrapado. Asegúrese de evacuar todo el aire de la jeringa antes de proceder, ya que interfiere con la contracción piezoeléctrico adecuado responsable de chorro. </li><li> Instalar un filtro de 0,22 micras en el extremo de la jeringa. Para evitar que el aire quede atrapado en el filtro, sostenga la jeringa vertical y empuje el émbolo hasta que una gota se forma encima de la punta. Nota: Un33 mm unidad de filtro de jeringa de diámetro fue encontrado para trabajar mejor, pero los filtros alternativos tan pequeño como un filtro de jeringa de 3 mm de diámetro se puede utilizar para reducir el volumen muerto. </li><li> Desatornillar el adaptador Luer hembra de la inyección de tinta, y de forma segura presione en su lugar sobre el extremo del filtro. De nuevo, expulsar el fluido para evitar que quede aire atrapado. Tornillo en la parte superior de la inyección de tinta. El fluido debe viajar a la punta de la inyección de tinta después de que esté completamente colocado. </li></ol> 3. Preparando el Equipo <ol><li> El uso de un v-clamp, montar el conjunto de la jeringa en la platina del microscopio. Conecte el cable de la inyección de tinta para el controlador de inyección de tinta. Nota: Una etapa costumbre fue construido para este protocolo, mientras que el diseño de la etapa puede ser determinado por el usuario, es fundamental para tener un control xyz independiente de la jeringa y el control xy del soporte de la muestra. </li><li> Determinar el aumento y la combinación de lentes necesario para alcanzar la proyección de imagen deseada. Aquí se usa un objetivo de 10X y 10X ocular. </li&gt; <li> Utilice una cámara de alta velocidad (≥ 1.000 fps) para visualizar el chorro y la generación de vesículas. Antes de la proyección de imagen, realizar la calibración de la cámara es necesario. Utilizar la imagen basada en auto-disparo en el software de la cámara para iniciar la captura de imágenes. </li><li> Monte la cámara de infinito en la platina del microscopio. Asegure la cámara con cinta adhesiva en su lugar en el escenario. </li><li> Alinee con cuidado la punta de inyección de tinta con el agujero perforado en el caucho natural (ver Figura 1b). Para ello, llevar la inyección de tinta cerca de la cámara y ajustar la posición de los ojos, y luego hacer ajustes más precisos a través de la lente de un microscopio. Proceda con cautela, ya que los movimientos gruesos pueden dañar la punta de inyección de tinta. </li><li> Una vez que la inyección de tinta está alineado, una copia del conjunto de jeringa lejos de la cámara para evitar cualquier daño a la inyección de tinta durante la carga de los pozos. Asegúrese de que el movimiento de la inyección de tinta es unidireccional de modo que permanezca alineado con el orificio en la membrana. </li><li> Presione suavemente en la PLUNger del conjunto de jeringa hasta que se forma una pequeña gotita en la boquilla de inyección de tinta. Esto proporcionará algo de contrapresión inicial. </li><li> Introduzca los parámetros de chorro. Para una onda bipolar trapezoidal, utilice los siguientes parámetros: 20 kHz de frecuencia de pulso, tiempo 3 microsegundos aumento, 35 microsegundos de duración de pulso, 3 microsegundos de tiempo de otoño, 65 V de tensión aplicada (amplitud de pulso), y 100 pulsos por chorro de disparo (número de pulsos) . Sin embargo, la tensión aplicada (amplitud de pulso) y número de pulsos (pulsos de chorro por gatillo) se pueden variar para controlar el tamaño de vesícula. </li></ol> 4. Vesícula Generación <ol><li> Añadir 25-30 solución de lípidos l en suspensión en n-decano a la cámara de infinito, que cubre la superficie completa de ambos pozos. </li><li> Añadir 25 l de glucosa (de la misma osmolaridad que la solución de sacarosa) hasta el borde más exterior de un pozo, pipetear lenta y suavemente. Tras la deposición, debe formar una gota de glucosa, debido a que la glucosa y la solución de lípidos no se mezclan. Añadir otra 251; l de glucosa para el bienestar opuesta, lo que hará que otra gota y formar la membrana de bicapa lipídica en el centro de la cámara dentro de 5-10 min. </li><li> Inserte la inyección de tinta a través del caucho natural, y con cuidado guíe hacia la bicapa interfaz de gota. Acércate a la bicapa lentamente, como la inyección de tinta introducida desplazará volumen y se puede romper la bicapa. </li><li> Cuando la inyección de tinta está dentro de ~ 200 micras, aplique el chorro con los ajustes que se describen en el paso 3.8. La distancia desde la bicapa puede variar principalmente en función del número de impulsos de voltaje y, entre otros parámetros. Este protocolo recomienda aumentar lentamente ajustes (voltaje y número de pulsos) y observar la deformación bicapa. </li></ol> 5. Limpieza del equipo <ol><li> Separe el conjunto de la jeringuilla de la platina del microscopio, y disponer de la jeringa de plástico de 1 ml y filtrar. </li><li> Para limpiar la inyección de tinta, aspirar las siguientes soluciones en orden por inmersión de la punta en la soluciN 7-10x cada uno: etanol al 70%, solución Neutrad 2% en agua caliente, etanol al 70%, y ddH 2 O. Si la inyección de tinta no se ajusta firmemente en la pipeta de aspiración, cortar una punta de pipeta para formar un adaptador. </li><li> Secar la cámara con el tejido. Coloque la cámara de infinito en un vaso de 250 ml con un 2% v / v Neutrad en agua caliente y déjelos en remojo durante 5-10 min. Después de ultrasonidos, secar bien los pocillos bajo aire comprimido. Cualquier humedad en los pocillos puede comprometer la estabilidad de la membrana de bicapa lipídica, por lo que también se recomienda que las cámaras se colocan en un horno a 60 ° C durante 15 min. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).</li><li>Yeh, B. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+lessons+from+the+history+of+synthetic+organic+chemistry.">Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).</li><li>Liu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-induced+bundling+of+actin+filaments.">Membrane-induced bundling of actin filaments.</a> Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).</li><li>Brown, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle.">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320, 789-792 (2008).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).</li><li>Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles+as+Biochemical+Compartments:+The+Use+of+Microinjection+Techniques.">Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques.</a> Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).</li><li>Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+emulsion+templated+monodisperse+phospholipid+vesicles.">Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles.</a> Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).</li><li>Matosevic, S., Paegel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+Synthesis+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+a+Microfluidic+Assembly+Line.">Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).</li><li>Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Fabrication+of+Asymmetric+Giant+Lipid+Vesicles.">Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+formation+of+unilamellar+lipid+vesicles+for+cell-like+encapsulation.">Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation.</a> Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).</li><li>Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicle+electroformation+from+lipid+mixtures+to+native+membranes+under+physiological+conditions.">Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions.</a> Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).</li><li>Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+control+of+giant+unilamellar+vesicles+prepared+from+inverted+emulsion+droplets.">Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets.</a> J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li><li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting.">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).</li><li>Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-coated+microdroplet+array+for+in+vitro+protein+synthesis.">Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis.</a> Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+serves+as+a+membrane+domain+switch+in+model+lipid+bilayers.">Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers.</a> Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Muchas técnicas se han desarrollado para la generación de vesículas, incluyendo electroformation, emulsión, y la generación de gotitas 14-16. Sin embargo, las nuevas técnicas experimentales son necesarios para permitir el diseño de sistemas biológicos con la creciente similitud con los sistemas vivos. Métodos de microfluidos, en particular, han ofrecido un mayor nivel de control que rige unilamellarity membrana, monodispersidad de tamaño, y los contenidos internos 17,18, con lo que los mo...

<html> Se ha convertido cada vez más claro que la biología celular es un problema multi-escala que implica integrar nuestra comprensión de las moléculas a las células. En consecuencia, saber con precisión cómo las moléculas trabajan en forma individual no es suficiente para comprender los comportamientos celulares complejos. Esto se debe en parte a la existencia de comportamientos emergentes de sistemas de varios componentes, como se ejemplifica en la reconstitución de la interacción actina red con vesículas de bicapa lipídica 4, el montaje de huso mitótico en Xenopus extracto 5, y la dinámica espacial de los mecanismos de división celular bacteriana 6. Una forma de complementar el enfoque de la reduccionista de la disección de los procesos moleculares de los sistemas vivos es tomar el camino contrario de la reconstitución de comportamientos celulares utilizando un conjunto mínimo de componentes biológicos. Una parte crítica de este enfoque implica la encapsulación fiable de biomoléculas en un volumen confinado, una característica clave de una célula. e_content &quot;&gt; Existen varias estrategias para encapsular biomoléculas para el estudio de sistemas biomiméticos. El sistema más biológicamente relevante es membranas bicapa de lípidos, que imitan las limitaciones físicas y bioquímicas impuestas por la membrana plasmática de la célula. formación de vesículas unilamelares gigantes (Guvs) por electroformation 7, una de las técnicas más ampliamente utilizadas para la generación de GUV 14, tiene típicamente un pobre rendimiento de encapsulación debido a su incompatibilidad con tampón de alta concentración de sal 8. Electroformation también requiere grandes volúmenes de muestra (&gt; 100 l), lo que podría ser un problema para trabajar con proteínas purificadas , e incorpora de manera ineficiente moléculas grandes debido a la dificultad de difusión entre las capas de lípidos estrechamente espaciados. Se han desarrollado varios enfoques de microfluidos para la generación de vesículas de lípidos. Los métodos de emulsión doble, que pasan a través de dos componentes de las interfaces entre las capas de aceite-agua-agua (W / O / W), se basa en la evaporación de un VOlatile disolvente para impulsar la formación de bicapa lipídica 9. Otros han utilizado una línea de montaje de microfluidos que produce una corriente continua de vesículas bicapa de lípidos 10 o en dos etapas independientes 11. Hemos desarrollado una técnica alternativa basada en la aplicación rápidamente pulsos de fluido contra una bicapa interfaz de gotita 12 para producir GUVs de tamaño controlado, composición, y la encapsulación. Nuestro enfoque, conocido como chorro de microfluidos, ofrece las ventajas combinadas de varias técnicas de generación de vesículas existentes, proporcionando un enfoque para la creación de sistemas biomoleculares funcionales para la investigación de una variedad de problemas biológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:633px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:160px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Piezoelectric Inkjet</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">MJ-AL-01-xxx</td>
			<td style="width:160px;">xxx denotes orifice diameter in microns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Jet Drive III Controller</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">CT-M3-02</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">High-speed camera</td>
			<td style="width:163px;">Vision Research</td>
			<td style="width:157px;">MiroEX2</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">DPhPC lipid in chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Avanti</td>
			<td style="width:157px;">850356C</td>
			<td style="width:160px;">Ordered in small aliquots in vials</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">33mm PVDF filters, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">1ml syringes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">14823434</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">n-Decane</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">111871000</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">410950010</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">S7903-1KG</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9084958</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:153px;">1/8&#34; Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">8560K239</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">0.2 mm Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">Astra Products</td>
			<td style="width:157px;">Clarex clear 001</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Acrylic Cement</td>
			<td style="width:163px;">TAP Plastics</td>
			<td style="width:157px;">10693</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Loctite 495 Superglue</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9011323</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive</td>
			<td style="width:163px;">Strobels Supply</td>
			<td style="width:157px;">30765</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Natural rubber</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">85995K14</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Custom stage</td>
			<td style="width:163px;">Home made</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs are available upon request</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer vesicle generation using microfluidic jetting

De abajo hacia arriba la biología sintética presenta un nuevo enfoque para la investigación y la reconstitución de los sistemas bioquímicos y, potencialmente, organismos mínimos. Este campo emergente involucra ingenieros, químicos, biólogos y físicos para diseñar y ensamblar componentes biológicos básicos en los sistemas complejos, que funcionan desde abajo hacia arriba. Tales sistemas ascendentes podrían conducir al desarrollo de las células artificiales para investigaciones biológicas fundamentales y terapias innovadoras 1,2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs) pueden servir como una plataforma modelo para la biología sintética debido a su estructura de la membrana alveolar y tamaño. De chorro de microfluidos, o microjetting, es una técnica que permite la generación de GUVs con un tamaño controlado, composición de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación 3. El principio básico de este método es el uso de múltiples pulsos de fluido, de alta frecuencia generadas por un dispositivo de inyección de tinta piezoeléctrico accionado para deformar una L suspendidabicapa IPID en un jefe. El proceso es similar a soplar burbujas de jabón a partir de una película de jabón. Mediante la variación de la composición de la solución de hidromasaje, la composición de la solución que abarca, y / o los componentes que se incluyen en la bicapa, los investigadores pueden aplicar esta técnica para crear vesículas personalizadas. En este trabajo se describe el procedimiento para generar vesículas simples de una bicapa de interfaz de gota por microjetting.

Hemos reunido una configuración de chorro de microfluidos en un microscopio de fluorescencia invertido convencional con una etapa de encargo montado a partir de piezas mecanizadas y manuales micrómetros (Figura 1). Caracterización de la inyección de tinta ofrece información sobre el proceso de generación de vesículas. La variación de la distancia entre la boquilla de inyección de tinta y bicapa lipídica afecta a la fuerza aplicada para causar la deformación de la membrana. Muy cercano a la bi...

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Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

De chorro de microfluidos contra una bicapa lipídica interfaz de gotita ofrece una manera fiable para generar vesículas con el control de la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación de material. Esta técnica se puede aplicar para estudiar una variedad de sistemas biológicos en los que se desean biomoléculas compartimentadas.

Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K vistas.  University of Michigan.  De chorro de microfluidos contra una bicapa lipídica interfaz de gotita ofrece una manera fiable para generar vesículas con el control de la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación de material. Esta técnica se puede aplicar para estudiar una variedad de sistemas biológicos en los que se desean biomoléculas compartimentadas. 

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Investigación

Bioingeniería

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Múltiples pasos Fotolitografia variable Altura de múltiples capas con válvula dispositivos de microfluidos

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Formulación y caracterización de nanopartículas lipídicas para la administración de genes utilizando una plataforma de mezcla microfluídica

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell cultures. Microcarrier culture technology has become one of the main techniques in cytological research and is commonly used in the field of large-scale cell expansion. Microcarriers have also been shown to play an increasingly important role in in vitro tissue engineering construction and clinical drug screening. Current methods for preparing microcarriers include microfluidic chips and inkjet printing, which often rely on complex flow channel design, an incompatible two-phase interface, and a fixed nozzle shape. These methods face the challenges of complex nozzle processing, inconvenient nozzle changes, and excessive extrusion forces when applied to multiple bioink. In this study, a 3D printing technique, called alternating viscous-inertial force jetting, was applied to enable the construction of hydrogel microcarriers with a diameter of 100-300 &#181;m. Cells were subsequently seeded on microcarriers to form tissue engineering modules. Compared to existing methods, this method offers a free nozzle tip diameter, flexible nozzle switching, free control of printing parameters, and mild printing conditions for a wide range of bioactive materials.

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Presented here is a mild 3D printing technique driven by alternating viscous-inertial forces to enable the construction of hydrogel microcarriers. Homemade nozzles offer flexibility, allowing easy replacement for different materials and diameters. Cell binding microcarriers with a diameter of 50-500 &#181;m can be obtained and collected for further culturing.

Impresión 3D de microportadores de hidrogel in vitro mediante chorro de fuerza viscoso-inercial alternado

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Generación de un modelo tridimensional simplificado de piel en un chip en una plataforma microfluídica micromecanizado

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and Pfizer/BioNTech. These vaccines have demonstrated the efficacy of mRNA-LNP therapeutics and opened the door for future clinical applications. In mRNA-LNP systems, the LNPs serve as delivery platforms that protect the mRNA cargo from degradation by nucleases and mediate their intracellular delivery. The LNPs are typically composed of four components: an ionizable lipid, a phospholipid, cholesterol, and a lipid-anchored polyethylene glycol (PEG) conjugate (lipid-PEG). Here, LNPs encapsulating mRNA encoding firefly luciferase are formulated by microfluidic mixing of the organic phase containing LNP lipid components and the aqueous phase containing mRNA. These mRNA-LNPs are then tested in vitro to evaluate their transfection efficiency in HepG2 cells using a bioluminescent plate-based assay. Additionally, mRNA-LNPs are evaluated in vivo in C57BL/6 mice following an intravenous injection via the lateral tail vein. Whole-body bioluminescence imaging is performed by using an in vivo imaging system. Representative results are shown for the mRNA-LNP characteristics, their transfection efficiency in HepG2 cells, and the total luminescent flux in C57BL/6 mice.

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Here, a protocol for formulating lipid nanoparticles (LNPs) that encapsulate mRNA encoding firefly luciferase is presented. These LNPs were tested for their potency in vitro in HepG2 cells and in vivo in C57BL/6 mice.

Prueba de la eficiencia in vitro e in vivo de nanopartículas lipídicas de ARNm formuladas mediante mezcla microfluídica

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...