El microambiente permite un complejo y dinámico que incluye citoquinas siempre cambiantes, concentración de ligandos y composición. Crear un ambiente de cultivo similar es crucial para estudios in vitro sobre maquinaria de vida compleja como la diferenciación de células madre, respuestas inmunes y el desarrollo de órganos en plataformas de chips. Pero generar y entregar señales químicas de volumen de nanolitro y precisión de milisegundos es difícil utilizar enfoques biomédicos convencionales como pipeteo.
Para hacer frente a los desafíos, una plataforma de cultivo que es capaz de la generación de adquisición de imágenes alternativas de entradas de señal combinatorias y secuenciales dinámicas está en alta demanda. En este protocolo, se presenta el procedimiento de diseño y fabricación de un dispositivo microfluídico. El chip microfluídico propuesto consta de 1500 unidades de cultivo, matriz de bombas peristálticas mejoradas y módulo de mezcla in situ.
Demostramos que la plataforma es adecuada para estudios en poblaciones celulares bidimensionales de células individuales y esferas neuronales tridimensionales. Las condiciones ambientales complejas y dinámicas en chip tienen grandes efectos en la diferenciación de células madre neuronales y la autorretración. El detalle de los procedimientos de diseño y fabricación es el siguiente.
El diseño del chip se realizó mediante el software AutoCAD. Para adaptarse al tamaño del soporte de la placa en el microscopio, el chip microfluídico es de aproximadamente siete por cinco centímetros de tamaño y consta de 1.500 cámaras de cultivo. Una de las características importantes es que tiene bomba peristáltica que consta de ocho canales de flujo y 200 canales de control de ancho de micrómetros.
El aumento del área superpuesta entre el control y el canal de flujo aumenta 16 veces en comparación con la bomba peristáltica, propuesta por Stephen Quake en 2002, a unos 15 nanolitros líquidos y por ciclo de bombeo y basta con las necesidades de mantener 1.500 condiciones ambientales independientes paralelamente en chip. Otra parte importante del dispositivo es una cámara de cultivo de dos capas, que puede mantener un entorno cultural libre de cizalla. El estrés de cizallamiento no deseado se previene al dirigirlo rápidamente a través de la capa superior.
Las células, los tejidos y el medio condicional crucial permanecen intactos en la capa inferior. La simulación numérica sugiere que cuando los líquidos se dirigen a través de cámaras de cultivo, de izquierda a derecha. las fuerzas de cizallación se pueden prevenir eficazmente.
Incluso a un caudal de entrada de 10 milímetros por segunda célula o tejido del tamaño de un micrómetro permanecen inalterados en la parte inferior de la unidad de cultivo. Fabricamos la réplica moldeando o oblea de silicio usando litografía UV. Los canales fluidos de 25 micrómetros de altura y 100 micrómetros de peso se producen utilizando fotoresista negativo SU-8 3025.
Las cámaras de cultivo de 75 micrómetros y 150 micrómetros de altura fueron fabricadas con su-8 3075 fotoresista. Az50X fotoresista positivo se utiliza para las características de pozo de forma redonda que se superponen con los canales de control para garantizar una buena conexión. Para producir el chip microfludico, las obleas de silicio estampados y en blanco fueron tratadas en primer lugar con TMCS.
Diferentes cantidades de PDMS 10 a 1 de la relación monómero-catalizador se mezclaron y depuraron a fondo durante una o dos horas en la cámara de vacío a menos 0,85 megapascal. La capa de control se obtuvo mediante recubrimiento de espín PDMS a 2.200 RPM. Las obleas de silicio fueron transferidas a incubadoras e incubadas durante 60 minutos a 80 grados centígrados.
Diferentes capas se alinearon y se unieron utilizando dispositivos ópticos personalizados y máquina de grabado de plasma. Los agujeros de entrada fueron perforados después de otras dos horas de unión térmica a 80 grados centígrados. El chip estaba unido a un resbalón de cubierta recubierto con PDMS, que es del mismo tamaño de placa de 96 pozos y se curó durante al menos 12 horas a 80 grados centígrados antes de su uso.
Para su funcionamiento, los canales de control se conectaron a válvulas solenoides neumáticas en miniatura a través de tubos de plástico. El giro de todos los pozos penumáticos fue controlado por un programa MATLAB personalizado a través de la interfaz gráfica de usuario. Las presiones de cierre óptimas de las válvulas de membrana PDMS push-up se determinaron individualmente para cada chip, que normalmente oscila entre 25 y 30 PSI.
Al girar toda la serie de pozos dinámicamente combinatorias y secuenciales se pueden generar entradas en chip. Las células fueron cosechadas al 80% de confluencia y resuspended con dmem medio de cultivo a una densidad de aproximadamente 10 a la potencia seis por mililitro, que luego se cargaron en el chip presionando la solución que contiene la célula. Tanto para el adherente como para el cultivo de suspensión de las células madre neuro, se recogieron células y las esferas se cargaron directamente en el chip.
Para la adquisición de imágenes, se utilizó un microscopio invertido con una etapa de traducción automática y la cámara semiconductora digital complementaria de óxido metálico. La adquisición de escenarios e imágenes se controló a través del software muestra la esquina superior izquierda y las cámaras de la esquina inferior derecha como puntos de selección y mover la etapa traslacional a los puntos ordenadamente para obtener la imagen preliminar con lente objetiva 4x. Cambia la lente objetivo 4x con la 20x y ajusta los parámetros de imagen incluyendo intensidad de la luz, tiempo de exposición, etcétera.
A continuación, localice los puntos de selección para que la posición de cada cámara salga de 13 por 15 matriz de cámara o que el programa los defina automáticamente. Con la determinación de las coordenadas de las cámaras, la etapa traslacional se mueve a cada cámara donde el plano focal X, Y, Z se puede ajustar. Establezca el intervalo y la duración del ciclo de imágenes.
Guarde la ruta y, a continuación, comience a crear imágenes. Este sistema está disponible para varios seguimiento dinámico objetivo, como la diferenciación de células madre neuronales en campo brillante y el campo de fluorescencia del proceso de formación de esferas de células madre neurales. análisis de datos.
Cambie el formato en nd2 a Tif utilizando el programa MATLAB personalizado. Y divida los datos según los puntos. Seleccionar objeto a analizar es célula o tejido.
Introduzca el umbral, el tamaño del objeto, el tamaño del ruido para el análisis. O puede elegir el análisis paso a paso para obtener parámetros óptimos. Y luego analizando todos los datos.
Después de guardar el resultado en formato MAT, utilice el trazado para dibujar los resultados o seguimientos. En este artículo, describimos el protocolo y la cultura del sistema de chips microfluídicos de alto rendimiento basado en la tecnología de fotolitografía para el control dinámico de microambientes de células vivas. También describimos algunos parámetros que uno debe controlar cuidadosamente, como la presión de cierre de las válvulas de membrana PDMS y el control de giro del fluido en paralelo de la cámara.
En el cultivo in vitro celular tradicional el tratamiento del entorno de cultivo celular se realiza manualmente, lo cual consume mucho tiempo y laborioso y lleno de líquido no es fácil de controlar. Particularmente minutos de solución. Hay algunos problemas como la generación de insumos, concentración de drogas inmunes y gran consumo.
Sin embargo, utilizando nuestro sistema microfluídico, es posible repetirlo como estimulador a una dosis fija de un solo fluido igual cantidad de concentración uniforme, comparar diferentes cultivos en diferentes cámaras de cultivo al mismo tiempo. Diferente con algunos estímulos de espalda de resolución temporal en miniatura y con subsecución de la resolución mediante la regulación del líquido. Además, nuestro sistema puede obtener un gran número de resultados experimentales comparativos por operaciones simples.
Nuestro sistema se basa en el principio de difusión, crea una mínima perturbación mecánica al microambiente celular. Para chips de microambiente celular más estables puede aumentar la lista de la capa de búfer como la profundidad de la capa de cultivo o reducir el fluido de entrada de intercambio medio, es decir, reducir la presión, que estará aquí para la investigación sobre el comportamiento celular. Es de notar que este estudio ha examinado sólo el cultivo de las células 3T3 y NSC.
Para otras celdas o líneas celulares, las condiciones de cultivo son comparables con nuestros parámetros para ajustarlo.
