Nuestro protocolo describe métodos para interferir eficientemente con la rotación autofágica inducida por el VHS-1 en células dendríticas. Y en particular, comparamos un inhibidor basado con una estrategia basada en siRNA para bloquear la autofagia antes de la infección. Mientras que la interferencia basada en inhibidores con la autofagia comprende efectos potenciales y específicos fuera de la diana, nuestra estrategia desarrollada basada en siRNA es más específica.
Es importante destacar que ambas técnicas presentadas no afectan las etapas de maduración de la enfermedad. Demostrando el procedimiento estarán Petra Muhl-Zurbes, una técnico, y Alexandra Duthorn, una estudiante de posgrado, de mi laboratorio. Comience por cosechar células dendríticas inmaduras o iDC enjuagando suavemente las células ligeramente adherentes de la parte inferior del matraz de cultivo celular en el día cuatro después de la adherencia.
Agregue un cóctel de maduración a las células para generar células dendríticas maduras o mDC. Dos días después de la inducción de la maduración, enjuague los mDC desde la parte inferior del matraz de cultivo celular. Repita el enjuague dos veces y, a continuación, transfiera los iDC y los mDC a tubos de 50 mililitros en su medio de cultivo respectivo.
Cosecha las células a través de la centrifugación a 300 veces g durante cinco minutos. Resuspender suavemente las células en cinco a 10 mililitros de RPMI 1640 por matraz de cultivo celular y combinar las respectivas suspensiones de CC en un tubo. A continuación, cuantifique las células utilizando una cámara de conteo asegurándose de evitar alteraciones de temperatura al manipular los controladores de dominio.
Transfiera dos millones de iDC o mDC a un tubo de dos mililitros, centrifugarlos a 3, 390 veces g durante 1-1/2 minutos y deseche el sobrenadante. Suavemente las células en el medio de infección. Inhibir la vía de degradación lisosomal autofagosomal añadiendo 10 espautin-1 micromolares o una bafilomicina micromolar A1 al medio de infección una hora antes de la infección.
Añadir DMSO para el control sin tratar e incubar las células en un bloque de calentamiento a 37 grados Celsius con temblor a 300 RPM. Para estudios de infección, inocular las células con VHS-1 viriones en una multiplicidad de infección de dos. Agregue el volumen respectivo de tampón MNT como un control simulado e incubar las células en un bloque de calentamiento a 37 grados Celsius durante una hora con temblor.
Una hora después de la infección, recoger las células a través de centrifugación a 3, 390 veces g durante 1-1/2 minutos, luego aspirar el inóculo suavemente y resuspender las células en el medio de CC. Células tratadas con simulacros de semillas e células infectadas por el VHS-1 a una concentración final de un millón de células por mililitro en una placa de seis pozos. A las 16 a 24 horas después de la infección, cosecha iDC usando un rascador celular o mDC enjuagando, transfiere las células a un tubo de bloqueo seguro de 1.5 mililitros y recógelos a través de centrifugación a 3, 390 veces g durante 1-1/2 minutos.
Repita la cosecha y centrifugación con las células restantes en los pozos, luego lave el pellet una vez con un mililitro de PBS y resuspende vigorosamente las células en la mezcla de liasis. Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 10 minutos y luego calentar a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Realice el análisis de la página SDS y de la mancha occidental para verificar los niveles de proteína LC3B1 y LC3B2, P62, ICP0 e ICP5 y GAPDH.
El día 3.5 después de la adherencia, transfiera 12 millones de iDC a un tubo de 50 mililitros, centrifugarlos a 300 veces g durante cinco minutos, y luego deseche el sobrenadante. En paralelo, realice un análisis citométrico de flujo para supervisar el estado de maduración. Lave suavemente los iDC en cinco mililitros de Opti-MEM sin rojo fenol y centrifugarlos a 300 veces g durante cinco minutos.
Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 200 microlitros de Opti-MEM ajustando la concentración celular a seis millones de células por cada 100 microlitros. Agregue 75 picomoles de siRNA específica o revuelta FIP200 a electrocubotos de cuatro milímetros y transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a la cubeta respectiva. Pulse directamente los iDC utilizando un aparato de electroporación.
Después de la electroporación, transfiera los iDC a placas de seis pozos con medio de CC precalentado fresco, sembrando las células a una concentración final de un millón de células por mililitro y colóquelas en la incubadora. Después de 48 horas, examine la morfología de los iDC electroporados microscópicamente, luego cosecha las células con el rascador celular y transfiérectelas en tubos de 15 mililitros. Enjuagar los pozos con un mililitro de PBS complementado con 0.1%EDTA y transferir la solución a los tubos respectivos.
Luego divida las celdas para cada condición de siRNA como se describe en el manuscrito. Utilice 500.000 células para evaluar el estado de maduración y la viabilidad celular, utilice un millón de células para el análisis de manchas occidentales para verificar la eficiencia de derribo específica de FIP200 y utilice las células restantes para experimentos de infección por VHS-1. Los iDC y mDC generados fueron analizados fenotípicamente por citometría de flujo con el fin de excluir la contaminación con otros tipos de células y verificar su estado de maduración.
Las células se tiñeron con anticuerpos CD3 y CD14 para excluir la contaminación por células T y monocitos respectivamente. Las células se tiñeron para CD11c, que sirve como un marcador general muy expresado para los DC. Para evaluar el estado de maduración, se utilizaron anticuerpos CD80, CCR7, CD83 y MHCII porque estas moléculas están muy expresadas en DC maduros.
La microscopía de fluorescencia y la citometría de flujo se utilizaron para determinar la infección con EGFP expresando el VHS-1. Las señales GFP fuertes indican una infección casi completa de los iDC y los mDC. El análisis de manchas occidentales se utilizó para determinar si la spautin-1 o la bafilomicina A1 inhiben el flujo autofágico en las células infectadas por el VHS-1.
En los iDC, el flujo autofágico se demuestra por la disminución de la expresión de P62 y LC3B en ausencia de spautin-1 y bafilomicina A1 respectivamente. Por el contrario, la infección por VHS-1 de los mDC en ausencia de spautin-1 no afecta a la expresión de P62, mientras que el tratamiento con spautin-1 y BA1 indujo una acumulación de LC3B-II que refleja la inducción de la autofagia, pero un fallo de la rotación autofágica en los mDC. La reducción de los niveles de proteína FIP200 con electroporación de siRNA también provoca una fuerte disminución del flujo autofágico en los iDC infectados por el VHS-1.
Este protocolo de electroporación basado en siRNA para la inhibición de la autofagia no afecta a la viabilidad celular, el fenotipo de imagen o el establecimiento de la expresión de proteínaS HSV-1 en iDC. Nuestros protocolos de electroporación ofrecen la oportunidad de entregar especies distintas de ADN o ARN en enfermedades y otros tipos de células primarias. Posteriormente, se puede realizar una variedad de análisis moleculares, funcionales e infeccionados.
La estrategia basada en siRNA para el silenciamiento de la expresión en la enfermedad allana el camino para explorar la función de cualquier proteína de interés, también combinada con los posteriores ensayos funcionales.
