Los autores desean agradecer a Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., y Meagan O&#39;Brien, MD por su apoyo y comentarios. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y completado con fondos del NIH subvenciones Ruth L. Kirschstein Premios Nacionales del Servicio de Investigación para individuales becas predoctorales (F31) para promover la diversidad en la Investigación en Salud, (AI089030) y SR1 (AI081848 ).

Declaración de Ética: se obtienen y se almacenan para la investigación con el consentimiento de los donantes de muestras de investigación. Todas las muestras deben ser codificadas o anónimos antes de su uso. Este protocolo sigue las directrices de nuestra Junta de Revisión Institucional. 1. La diferenciación de los monocitos de sangre periférica humana en células dendríticas derivadas de monocitos. Nota: capas leucocitarias humanas sirven como la fuente de las células de sangre periférica humana (PBMC) y se obtuvieron del Centro de Sangre de Nueva York (Nueva York, Nueva York). Los donantes de sangre son voluntarios sanos. El procedimiento de 5 días comienza con el forro de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en matraces de cultivo de tejidos 35,36. Diferencias notables de los protocolos publicados son los siguientes: <ol><li> Utilice 225 cm 2 frascos de cultivo de tejidos de poliestireno no pirogénicos con una tapa de filtro para adherir un total de 2x10 8 PBMCs por frasco en lugar de 10 cm de poliestireno placa de cultivo de tejidoss (58 cm 2) (paso 1). </li><li> Preparar los medios de comunicación con 5% de suero humano combinado (PHS; 30 ml) en 500 ml de RPMI-1640 + L-glutamina, tampón 5 ml de HEPES 1 M, y 1,4 ml de 50 mg / ml de gentamicina (5% de PHS medios de comunicación) seguido por filtración a través un filtro de 20 mM. Añade un total de frasco de cultivo de 50 ml 5% PHS medios por 225 cm2 de tejido. </li><li> Lavar las células adheridas tres veces con 25 ml de RPMI-1640. Agitar enérgicamente durante 5 segundos durante cada lavado y aspirar las células no adherentes (paso 4). </li><li> Añadir 190 l de 400 UI / mu l de IL-4 y 380 l de 100 UI / l de GM-CSF por matraz (etapa 3) en el día 0, 2, y 4. Día 0 se define como el día PBMC se siembran inicialmente en el paso 1 (Paso 8). </li><li> Día de la Cosecha 5 moDCs a una concentración de 1x10 6 células / ml (paso 15). </li><li> Utilice moDCs inmediatamente en su estado de reposo. Pasos 17-22 nunca se llevan a cabo. Nota: Las muestras deben ser procesadas tan pronto como sea posible después de la recolección para obtener mejores resultados. </li><li> MoDCs alícuotas a una concentraciónción de 2x10 5 células / pocillo (200 l / pocillo de la 1x10 6 células / ml) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (western blot, ELISA, FACS) o sobre una chamberslide poli-L-lisina tratado (microscopía) para la experimentación . Nota: Hay por lo menos 4 condiciones: Completamente sin estimular (control negativo), el cebado sólo, sólo la activación, y cebado seguido de activación. Las condiciones pueden ser expandidos para incluir controles de diluyente para R848 y nigericina si se desea. Si el ensayo es aguas abajo del ICS, los duplicados son necesarios para los controles de isotipo. </li></ol> . 2 Cebado inflamasoma - Señal 1 <ol><li> Reconstituir liofilizado R848 en DMSO de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir solución de trabajo a TA con RPMI-1640. </li><li> Añadir R848 a una concentración final 10 mM a los pocillos durante 18 horas apropiarse. Coloque las células en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> 3 Activar la NLRP3 inflamasoma -. Señal2 <ol><li> Reconstituir nigericina liofilizado en etanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir solución de trabajo a TA con RPMI-1640 antes de añadir a las condiciones apropiadas. </li><li> Añadir nigericina a una concentración final 20 mM y volver a la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 6 horas. No hay etapas de lavado se producen entre el cebado y durante la activación. Nota: la secreción de IL-1β se incrementa por la presencia de ionóforos de calcio, brefeldina clorofenilhidrazona A, monensina, dinitrofenol, o cianuro de carbonilo 37, 38. Por lo tanto, la adición de estos inhibidores de secreción no son recomendables cuando se analiza el cebado o actividad inflamasoma ya que altera la secreción de IL-1β. </li></ol> 4. IL-1ß Sample Collection <ol><li> Centrifugar la placa con las células y los sobrenadantes a 974 xg durante 3 min. </li><li> Sin alterar el sedimento celular, aspirar el sobrenadante y transferir a comoSeparadas fondo redondo de placa con el fin de medir la secreción de citoquinas de los sobrenadantes. Nota: Los sobrenadantes se pueden almacenar temporalmente a -20 ° C o -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. </li><li> Lavar los pellets celulares tres veces con 200 l de 1x PBS a 974 xg durante 3 minutos para eliminar cualquier extracelular de IL-1β de las muestras celulares. Nota: Al lavar los sedimentos celulares de una placa de 96 pocillos, eliminar el lavado de placa por inversión rápida en una bandeja de recogida con el fin de no perturbar la muestra. </li></ol> 5. Medición de IL-1ß a partir de muestras celulares y el sobrenadante <ol><li> Intracelular de citoquinas tinción (ICS): El protocolo ICS se describe a continuación 39, 40. Nota: no suspender las células si el análisis de aguas abajo es la baciloscopia. Todos los lavados y aspiraciones deben hacerse sin alterar la capa de células / pellet (dependiendo del ensayo aguas abajo). <ol><li> Añadir 100 l de 5% de PHS medios en los pozos apropiados. Añadirvolumen apropiado (aproximadamente 1 μl/2x10 5 células, o 1 l / pocillo) de la etiqueta fluorescente α-CD11c y α-CD14 (marcadores de fenotipo; clon B-Ly6 y MφP9, respectivamente) o control de isotipo a las células durante 10 min a RT en la oscuridad. </li><li> Lavar tres veces con 1x PBS a 974 xg durante 3 min. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 100 l de PFA al 4% durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Pausa Point: Lavar con 100 l de PBS 1x a 974 g durante 3 min y se almacena a 4 ° CO / N en 1 × PBS. </li><li> Añadir 100 l de tampón de permeabilización a las células durante 30 min. Nota: tampón de permeabilización se compone de 1x PBS con 0,3% de Triton X-100, y 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante la permeabilización. No moleste a las células adherentes al ensayo de aguas abajo es la baciloscopia. </li><li> Añadir el volumen adecuado (células de aproximadamente 62 ng antibody/2x10 5, aproximadamente el 2,5 l / pocillo) de α-IL-1β-FITC (clon 8516) o control de isotipo para2 horas en una incubadora a 37 ° C. </li><li> Lavar las células tres veces con 200 l de tampón de permeabilización a 974 xg durante 3 minutos en la oscuridad. </li><li> Opcional: Mancha con DAPI, añadir medio de montaje, y colocar cubreobjetos suavemente en la parte superior de un portaobjetos de vidrio. Permitir medio de montaje para curar O / N antes de la captura de imágenes de microscopía. </li><li> Adquirir los datos por FACS o microscopía. Nota: Comparar el isotipo para cada condición de la tinción adecuada al analizar por FACS o microscopía. <ol><li> FAC: Adquirir una muestra a la vez. Establezca el / puerta SSC FSC en las células vivas, seguidas por gating en CD11c + CD14 - células antes de analizar la tinción pro-IL-1β población moDC. </li><li> Microscopía: Ajuste el tiempo de exposición utilizando la muestra positiva tinción - R848 tratada. Utilice DAPI + pro-IL-1β + y DAPI + pro-IL-1β - para determinar el porcentaje de pro-IL-1β + moDCs expresan. </li></ol></li></ol></li><li> SDS-Página: inmunotransferencia se realiza para detectar pro-IL-1β. Nota: La técnica descrita a continuación combina técnica estándar inmunotransferencia, gradiente de gel de poliacrilamida 4-20%, y la detección fluorescente o quimioluminiscente 41, 42. <ol><li> Lisar células directamente en 10 l de tampón de lisis de desnaturalización (5 l β-mercaptoethanol/950 tampón de muestra de Laemmli l seguido por dilución de 1:01 con tampón de lisis celular). Se transfiere el lisado a 1,5 ml de tubos de Eppendorf. </li><li> Lisado de calor en una placa seca durante 10 minutos a 100 ° C. </li><li> Girar lisado a 20.800 xg en un minicentrifuge durante 1 min para concentrar el volumen de líquido. Punto Pausa: las muestras pueden ser congeladas a -20 ° C para el almacenamiento a corto plazo. </li><li> Cargue el volumen total en el gel de poliacrilamida. Ejecutar 140 V a través de la caja de gel de aproximadamente 1 hora, o hasta que el frente del colorante se sale de la parte inferior del gel. </li><li> Transferencia de la proteína desde el gel de poliacrilamida sobre un membr de PVDF Immobilon-FLane durante 90 min a 100 V. Bloquear la membrana con 5% de BSA en solución salina tamponada de Tris / 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 h. Nota: PVDF Immobilon-FL es el mejor para su uso con detección fluorescente. Se recomienda una membrana con una composición diferente para otras técnicas de detección para aumentar la relación señal a fondo. </li><li> Diluir anticuerpos primarios y secundarios en 10 ml de 5% de BSA / TBS-T. Realizar las incubaciones de anticuerpos primarios a 4 ° CO / N mientras se agita y anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora mientras se agita. </li><li> Lavar la membrana 3 veces con TBS-T durante 5 minutos mientras se agita entre incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios y de nuevo entre incubaciones secundarias y de formación de imágenes. Nota: Las bandas se pueden detectar usando fluorescente o detección quimioluminiscente. Siga las instrucciones del fabricante para la detección. </li></ol></li><li> ELISA: Las muestras que se congelan para su almacenamiento es necesario que se equilibre a temperatura ambiente antes del análisis. Centrifugar las muestras en una centrífuga para consolidar de condensación de sobrenadanteación. Siga las instrucciones del fabricante para la medición de IL-1β. Nota: En este protocolo de IL-1β se mide específicamente; Sin embargo, la medición simultánea de TNFa, IL-6, y la citocina inmunomoduladora IL-10 se cebaron asegurar las condiciones apropiadas. </li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Las citocinas inflamatorias son integrales en la dirección de la respuesta inmune innata y adaptativa para combatir la infección viral. Secretada de IL-1β se ha demostrado que aumenta durante la infección por influenza 3, 43, 44. Los mecanismos precisos por los que estas citoquinas se procesan en respuesta al reconocimiento viral en células dendríticas humanas no se entienden completamente. Kits de aislamiento DC mieloides son costosos y requerir mucho tiempo. Kits de aislamiento y clasificación FAC pu...

Se requiere Activación del sistema inmune innato para dirigir la respuesta inmune adaptativa durante la infección, la enfermedad y la vacunación 7. Las células dendríticas son el antígeno más potente que presenta células del sistema inmune innato; están especializados para la captación de antígenos, la migración a los ganglios linfáticos, y la activación de citolítica CD8 + T-células 8-10 ingenuo CD4 + y. Para habilitar la detección de patógenos rápida del sistema inmune innato utiliza numerosos receptores de reconocimiento de patrón de la línea germinal codificada (PRR) que reconocen patógenos motivos conservados derivados o marcadores de acogida derivado de estrés celular y el daño. Receptores tipo Toll (TLRs) son los receptores de reconocimiento de patrones unidas a la membrana que reconocen ciertos patógeno fagocitado extracelular patrones asociados molecular (PAMP) y los patrones moleculares de peligro asociado (apaga). Por el contrario guiño como receptores (NLRs) son citosólicas y responder a una amplia gama de PAMP y DAMPS. Nod como receptores representar una segunda línea de defensa contra los patógenos que evaden superficie celular y PRRs endocítica. La interacción de los patógenos derivada, o &quot;peligro&quot; asociada, factores con TLR y NLR ligandos conduce a un estado de maduración de las DC que resulta en una mayor interacción DC con otras células inmunes y la promoción de las células T y activación de las células asesinas naturales 11. La interleucina-1β es un componente crucial de la defensa del huésped contra la infección. A partir del reconocimiento de un microorganismo, la citoquina altamente proinflamatorias, IL-1β, se secreta y funciona como un atrayente de quimioterapia y activador de las células inmunitarias innatas y adaptativas. In vivo de IL-1β es en gran parte responsable de la respuesta de fase aguda incluyendo fiebre y citoquina inflamatoria síntesis 12. La mayoría de NLRs contienen un dominio rico en leucina repetir el terminal C que se cree que funcionar en la detección de ligando, un dominio de unión de nucleótidos central (NACHT) que es importante para la oligomerización NLRP3, y un dominio efector terminal de N (PYD en NLRP3) que media la transducción de señales a través de objetivos de abajo interacciones proteína-proteína. La proteína NLRP3 define el complejo más intensamente estudiado inflamasoma. Esta proteína es un miembro de la familia de NLR y tiene la capacidad para formar un complejo de proteínas múltiples molecular compuesta de NLRP3, la PYCARD proteína adaptadora (también conocido como ASC), y el ICE. Después de la activación inflamasoma PYCARD une al terminal de dominios NLRP3 N y recluta a través de ICE (tarjeta) dominios de activación de caspasas y contratación de dominio. La interleucina-1 de la enzima convertidora se genera inicialmente como un zimógeno que contiene un motivo TARJETA en su extremo N-terminal. Resultados de formación inflamasoma en la unión de dos moléculas de ICE suficientemente cerca para inducir su activación autocatalítica. El complejo inflamasoma es necesaria para la activación de ICE por lo tanto lo que le permite convertir citoplásmica Pro-IL-1β para madurar citoquina. El éxito de la secreción de la IL-1β en los países en desarrollo requiere la detección de dos señales de peligro distintas e independientes. En primer lugar, TLR detección de PAMP, DAMPS, o la señalización de citoquinas (TNF o IL-1β) causa una regulación positiva de la expresión de la proteína citoplasmática pro-IL-1β. Se requiere una segunda frecuencia diferente, señal, para la formación de complejos inflamasoma aguas arriba de la maduración del ICE. Algunos inflamasoma estimular señales incluyen toxinas de los poros de la membrana bacteriana que forman (como nigericina), lisosomales interrumpir cristales (tales como cristales de urato monosódico, MSU) y ATP extracelular. El mecanismo ascendente que conduce a la activación NLRP3 inflamasoma por estos diversos activadores no está claro. Estudios de investigación de aguas arriba de señalización de la formación de inflamasoma propone que los eventos intracelulares, tales como la inducción de la hipopotasemia o especies reactivas de oxígeno (ROS) activan indirectamente la inflamasoma 13-28. Entre los diferentes activadores virales del inflamasoma NLRP3 es la influenza, que proporciona banto la señal primaria y secundaria requerida para la secreción de IL-1β 3, 29-33. Utilizando modelos knockout NLRP3 ratón se encontró que la secreción de IL-1β en los países en desarrollo es NLRP3 dependiente 32. Además, los ratones knockout NLRP3 atraídos menos leucocitos al sitio de la infección y experimentaron una mayor mortalidad 2, 5. Dos estudios recientes sugieren un mecanismo para la activación inflamasoma NLRP3 durante la infección por el virus de la influenza; primero, el cebado a través del reconocimiento de ARN viral por TLR7 o TLR8 (dependiendo de TLR expresión de la célula de responder) o a través de sensores de las bacterias comensales por otro TLR para inducir la expresión en favor de la IL-1β citoplásmica, seguido por una segunda señal, la activación de NLRP3 formación inflamasoma por la proteína viral del canal iónico M2 en la red trans del Golgi 33, 34. En este último paso, la activación del inflamasoma NLRP3 se logra mediante la alteración de la iónica intracelular &lt;em&gt; entorno que conduce a la producción de ROS, que es, simplemente, detectada por NLPR3 como una señal para formar el inflamasoma. Sin embargo, el mecanismo exacto de la activación aguas arriba inflamasoma de la actividad de ICE durante la infección por influenza sigue siendo poco clara. Este trabajo describe una técnica valiosa para el estudio de la inflamasoma NLRP3 en moDCs humanos que se puede utilizar como una base para la investigación adicional de la vía subyacente DC basado secreción de IL-1β en respuesta a TLR8 ligadura con R848 seguido por la activación de la inflamasoma por un pozo conocido activador de la NLRP3, nigericina. Las variaciones de este método se puede utilizar con otros tipos de células incluyendo, pero no limitados a: los monocitos, macrófagos, otros subconjuntos de DC, y células epiteliales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Los procesos inflamatorios resultantes de la secreción de interleucina (IL) -1 citocinas de la familia de las células inmunes conducen a la inflamación local o sistémica, remodelación y reparación de tejidos, y el control virológico 1, 2. La interleucina-1β es un elemento esencial de la respuesta inmune innata y contribuye a eliminar los patógenos invasores al tiempo que evita el establecimiento de la infección persistente 1-5. Inflamosomas son la plataforma de señalización clave para la activación de la interleucina 1 de la enzima convertidora (ICE o caspasa-1). El inflamasoma NLRP3 requiere al menos dos señales en los países en desarrollo para hacer que la secreción de IL-1β 6. Pro-IL-1β expresión de la proteína se limita en las células en reposo; por lo tanto, se requiere una señal de cebado para la transcripción de IL-1β y expresión de la proteína. Una segunda señal detectada por los resultados NLRP3 en la formación de la inflamasoma NLRP3 multi-proteína. La capacidad de las células dendríticas para responsabilidadd para las señales requeridas para la secreción de IL-1β se puede probar usando una purina sintética, R848, que es detectado por TLR8 en monocitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) a las células principales, seguido por la activación de la inflamasoma NLRP3 con la toxina bacteriana y ionóforo de potasio, nigericina. Monocitos DCs derivadas son fácilmente producidos en la cultura y proporcionan significativamente más células que purificados mieloide países en desarrollo humano. El método presentado aquí se diferencia de otros ensayos inflamasoma en que se utiliza en humanos in vitro, en lugar de ratón derivada, permitiendo así que los países en desarrollo para el estudio de la inflamasoma en la enfermedad humana y la infección.

Estas técnicas miden TLR8 cebado con R848. Tinción intracelular de citoquinas para pro-IL-1β permite microscopía y FAC lecturas de CD14 - CD11c + moDCs. Ambas técnicas se pueden cuantificar con relación a un no imprimado, o de descanso, el control celular, así como un control de isotipo (Figuras 1 y 2). Porcentaje de células pro-IL-1β + tinción se multiplica por la mediana geométrica de esta población para proporcionar la intensidad de fluorescencia media (MF...

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Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Las células dendríticas (DCs) secretan IL-1β en respuesta al reconocimiento TLR8 de purina sintética, R848, seguido por la activación inflamasoma NLRP3 con nigericina, por lo tanto, la IL-1β se puede utilizar para medir la actividad inflamasoma NLRP3. Tinción intracelular de citoquinas, inmunotransferencia, ELISA y se utilizan para medir con precisión NLRP3 inflamasoma el cebado y la activación a través de la expresión de IL-1β.

Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

20.7K vistas.  New York University School of Medicine.  Las células dendríticas (DCs) secretan IL-1β en respuesta al reconocimiento TLR8 de purina sintética, R848, seguido por la activación inflamasoma NLRP3 con nigericina, por lo tanto, la IL-1β se puede utilizar para medir la actividad inflamasoma NLRP3. Tinción intracelular de citoquinas, inmunotransferencia, ELISA y se utilizan para medir con precisión NLRP3 inflamasoma el cebado y la activación a través de la expresión de IL-1β. 

Video: Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

This study describes a novel microplate assay that measures FV coagulation activity during fibrin clot formation in human plasma which has not been reported previously. The method uses a kinetic microplate reader to continuously measure the change in absorbance at 405nm during fibrin clot formation in human plasma.

Medición de actividad de factor V en el plasma humano usando un ensayo de coagulación de microplacas

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Investigación

Inmunología e Infección

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

Cuantificación de la actividad quimiotáctica monocitos en Vivo y caracterización de los macrófagos derivados de monocitos sanguíneos

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

electroporación de siRNA para modular la autofagia en el virus del herpes simple tipo 1-Células dendríticas derivadas de monocitos infectados

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

Estimulación in Vitro y visualización de la liberación de trampas extracelulares en macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

Determinación de la inmunogenicidad de la vacuna utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...