Este protocolo representa un ensayo funcional in vitro utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos para medir la inmunogenicidad de la vacuna antes de los estudios in vivo. Por lo tanto, llenar un vacío existente en la vacunología del ganado. Es la generación y aplicación de células dendríticas.
Como las células presentadoras de antígeno más potentes, las células dendríticas se han convertido en un objetivo de investigación clave para comprender los mecanismos inmunes intracelulares, incluida la eficacia de la vacuna. Este ensayo se puede implementar como una herramienta para la detección de vacunas candidatas, como un estado de control de calidad para la producción de vacunas y para la selección de antígenos y adyuvantes. Demostrando el procedimiento estará Richard Kangethe, científico del laboratorio de producción y salud animal.
Comience invirtiendo y mezclando la sangre obtenida de la punción de la vena yugular de la pantorrilla con vacutainers heparinizados. Luego transfiera 20 mililitros de sangre heparinizada a un tubo estéril de 50 mililitros y dilúyalo con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS. Pipetear 15 mililitros de medio de aislamiento de linfocitos a un tubo estéril de 50 mililitros e inclinar el tubo a una posición de 45 grados.
Coloque cuidadosamente 30 mililitros de medio PBS en sangre sobre el aislamiento de linfocitos con una pipeta de 25 mililitros y devuelva lentamente el tubo a una posición vertical antes de centrifugarlo. Luego recolecte la fina capa blanca de células mononucleares de sangre periférica o capa de PBMC usando una pipeta Pasteur y transfiérala a un nuevo tubo de 50 mililitros. Lave los PBMC cosechados dos veces usando 40 mililitros de PBS por lavado y mezcle bien.
Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 15 mililitros de tampón de potasio de cloruro de amonio o tampón ACK. Después de 10 a 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, agregue hasta 40 mililitros de PBS y centrifugue el tubo con la máxima aceleración y desaceleración. Resuspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo completo.
Luego agregue cinco microlitros de tampón CD14 MicroBead por cada 10 millones de células y mezcle bien con una pipeta. Para el análisis de citometría de flujo, agregue 10 microlitros de isotiocianato de fluoresceína CD14 o anticuerpo de tinción FITC a las PBMC e incube durante 15 minutos a cuatro a ocho grados centígrados antes de proceder con la citometría de flujo. A los PBMC sin teñir, agregue un mililitro de tampón de fax y centrifugarlo durante siete minutos a 500 g y cuatro grados centígrados.
Luego vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de fax por cada 100 millones de células. A continuación, inserte la columna de separación de células inmunomagnéticas en el separador y coloque un tubo de recolección de 50 mililitros debajo de la salida de la columna para recoger el flujo. Después de lavar la columna con un tampón de fax desgasificado de un mililitro, reemplace el tubo de 15 mililitros usado por uno nuevo.
Pipetear cien millones de células en 500 microlitros de tampón a la vez permitiendo que la suspensión celular pase a través de la columna. Luego enjuague la columna tres veces con tres mililitros de tampón de fax desgasificado cada vez. Después de recolectar el flujo continuo, marque la primera fracción de linfocitos naïve eluyentes como la fracción de células CD14 negativas.
Retire la columna del separador y coloque un nuevo tubo estéril de 15 mililitros debajo de la columna para la recolección de efluentes. Agregue cinco mililitros de búfer de fax en la columna e inmediatamente empújelo usando el émbolo. Recoja y etiquete el segundo flujo a través o la fracción de monocitos naïve como la fracción de células CD14 positivas.
Agregue un medio de cultivo completo a los monocitos CD14 positivos cosechados para alcanzar 1 millón de células por mililitro. A continuación, agregue una suspensión de células de mililitros a cada pocillo de una placa estéril de 24 pocillos antes de complementar cada pocillo con 40 microlitros del cóctel de citoquinas proporcionado en el kit. En el segundo día, transfiera la mitad del contenido de cada pozo a tubos individuales de 1,5 mililitros con una pipeta.
Después de centrifugar los tubos de 1,5 mililitros a 500 g durante siete minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de medio de cultivo completo fresco. Transfiera 500 microlitros de esta suspensión celular resuspendida a los pocillos correspondientes para que el volumen final en el pozo se convierta en un mililitro. Enriquece cada pozo con 20 microlitros de cóctel de citoquinas.
Para generar MoDC pulsados por antígeno, agregue un microlitro por mililitro de vacuna contra el virus de la rabia o suspensión de RV a un mililitro de cultivo de MoDC ingenuo en la placa de 24 pocillos e incube la placa durante 48 horas al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados. En el séptimo día, mantenga la placa de 24 pocillos que contiene los MoDC pulsados por antígeno en hielo durante 10 minutos antes de agregar un mililitro de PBS helado por pocillo y mezclarlo bien. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros.
Lave los pozos con dos mililitros de PBS helado. Recoger las células residuales dentro de cada pocillo y transferir el contenido lavado a sus respectivos tubos. Centrifugar la suspensión celular a 500g durante siete minutos.
Después de desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet de células MoDCs pulsadas por antígeno en un medio de cultivo completo para ajustar la concentración final de 100, 000 células por mililitro. Para el cultivo conjunto de linfocitos MoDC, siembre los pocillos de una placa estéril de 24 pocillos con un mililitro de suspensión de células linfocitarias naïve y un mililitro de suspensión de MoDC pulsada por antígeno o no pulsada por antígeno en el séptimo día del pulso de antígeno. Después de dos días de incubación, complementar cada pocillo con 20 nanogramos por mililitro de interleucina-2 recombinante y continuar la incubación durante otras 120 horas.
El día 14, transfiera un mililitro del cocultivo a un tubo estéril de 1,5 mililitros y centrifugar el tubo. Luego resuspenda el pellet celular con un mililitro de MoDC pulsados o no pulsados por antígeno. Mezclar bien y transferir las suspensiones celulares a sus pocillos correspondientes.
Después de la tinción de la superficie celular de las PBMC y los linfocitos y monocitos naïve, transfiera un mililitro de la suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 mililitros con una pipeta y una centrífuga durante 10 minutos a 500 g. Luego vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros. También recoger las células residuales y los tubos correspondientes utilizando un mililitro de PBS.
Luego agregue 10 mililitros de PBS al tubo de 15 mililitros que contiene las celdas y mezcle por pipeteo. Después de centrifugar el tubo durante siete minutos a 850 g, retire el sobrenadante y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet celular con la suspensión residual que queda después de decantar el sobrenadante. Transfiera la suspensión celular a una placa de 96 pocillos con fondo en V y selle los pocillos para evitar derrames.
Una vez que se complete la tinción, realice el análisis del citómetro de flujo. Desde la vista previa en tiempo real, ajuste el umbral de fluorescencia, incluido el voltaje y la ganancia y el tamaño de la celda, para eventualmente dibujar puertas alrededor de la población celular deseada mientras excluye cualquier residuo celular. La tinción de células CD14 y la citometría de flujo mostraron que la fracción de monocitos naïve comprendía 98% de células de monocitos CD14 positivas y era funcionalmente capaz de captación de antígenos.
Los MoDC ingenuos caracterizados fenotípicamente por evaluar la expresión de MHC Clase 2 y marcadores de superficie celular CD86 y CD40 coestimuladores validaron las células dendríticas o el fenotipo tipo DC. Durante el cocultivo de linfocitos MoDC en el día nueve, se observó un cambio morfológico que muestra la extensión de la dendrita en el pulso del VD a los MoDC. En comparación con el cultivo de linfocitos MoDC no pulsados, se demostró un aumento significativo en la proliferación de linfocitos mediante la regulación positiva de los marcadores de activación Ki67 y CD25 en las células T CD4 positivas y CD8 positivas el día 16 en el cocultivo de linfocitos MoDC pulsados.
Las células T CD8 positivas de los cocultivos maduros de MoDC pulsados de RV exhibieron una regulación positiva de Ki67 ocho veces en comparación con el grupo no específico. Las células CD4 positivas en el mismo cocultivo mostraron un aumento de siete veces en Ki67 en comparación con los controles, lo que demuestra la capacidad de los MoDC preparados para RV para presentar el antígeno RV a los linfocitos naïve y activarlos en una condición in vitro. La cuantificación de qPCR de cocultivos mostró un aumento de más del 30% en la expresión de interferón gamma y más del 5% de aumento en la expresión de Ki67 en todos los cocultivos utilizando GAPDH como calibrador.
Se observó una concentración significativamente mayor de interferón gamma secretada en el cocultivo de linfocitos MoDC pulsados por RV en comparación con el grupo de tratamiento no específico. Realice el paso de estratificación muy lenta y cuidadosamente, asegurándose de que la sangre se coloque sobre el medio de aislamiento de linfocitos. Tenga mucho cuidado de recolectar todos los PBMC sin recolectar demasiado material de las otras capas.
Otros métodos como la citometría de flujo, ELISA y PCR cuantitativa, entre otros, se pueden aplicar después de este procedimiento para evaluar la activación de marcadores inmunes.
