El virus oncolítico del herpes simple es una forma emergente de inmunoterapia contra el cáncer. Un sistema eficiente de propagación de virus, purificación y determinación titérica es fundamental para su uso en estudios experimentales. Este método es muy simple y se puede adoptar fácilmente en cualquier entorno de laboratorio de nivel dos de bioseguridad para recibir un stock viral de alta calidad para estudios preclínicos.
La producción de un stock viral puro y de alta calidad es crucial, ya que se utiliza para estudiar la respuesta inmune contra el cáncer y para desarrollar una nueva forma de inmunoterapia contra el cáncer basada en virus. Este protocolo se puede utilizar para purificar cualquier virus de herpes simple de tipo salvaje o genéticamente modificado. Este protocolo debe ser fácil de leer y fácil de seguir para un individuo que nunca ha realizado esta técnica antes.
Los materiales y reactivos enumerados deben estar en su lugar antes de probar esta técnica por primera vez. Comience lavando los frascos de T-150 centímetros cuadrados con dpbs de glucosa dos veces alta complementado con 1% IFCS. Aspirar el DPBS y añadir siete mililitros de inóculo del virus por matraz.
Mezcle suavemente los frascos durante cinco minutos e incube a 37 grados centígrados durante 1,5 a 2 horas. A continuación, retiramos el inóculo y añadimos 25 mililitros de DMEM suplementados con 1%IFCS a cada matraz. Después de la incubación a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos a cuatro días, recoger 20 mililitros del sobrenadante de cultivo de cada matraz en tubos de centrífuga de 50 mililitros.
Usando un raspador de células, raspe las celdas de la parte inferior de los frascos. Agregue aproximadamente 15 mililitros del sobrenadante de cultivo previamente recogido a cada matraz para llevar el volumen hasta 20 mililitros, luego use una pipeta serológica estéril de 10 mililitros para lavar suavemente el fondo de los frascos unas cuantas veces. Recoger las células con el medio en 50 mililitros tubos de centrífuga cónica colocados en el hielo.
Centrifugar los tubos a 300 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados. Resuspend cada pelotilla a fondo en 1.25 mililitros del almacenador intermediario del virus, o VB, y 1.25 mililitros del sobrenadante previamente recogido de la cultura. Mezcle todos los pellets resuspended en un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros.
Congele las células resuspended usando hielo seco y etanol al 100% y guárdelo a menos 80 grados Centígrados. Descongelar las células congeladas previamente rompidas en un baño de agua caliente a 37 grados Centígrados y sonicar durante un minuto durante tres ciclos en un baño de agua. Añadir 175 unidades de Benzonasa Nucleasa y dos microlitros de dos milimolares cloruro de magnesio por mililitro del lisato celular y vórtice.
Después de una incubación de 30 minutos y baño de agua tibia a 37 grados centígrados, coloque el tubo sobre hielo. Gire el lysate de la célula en 300 veces G durante 10 minutos. Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros y resuspend el pellet celular en 500 microlitros de VB. Designarlo como pellet uno.
Gire el sobrenadante recogido de nuevo a 500 veces G durante 10 minutos y guarde el sobrenadante por separado en un tubo de centrífuga cónico fresco de 50 mililitros para usarlo más tarde. Resuspend el pellet celular en 500 microlitros de VB, designándolo como pellet dos. Combine el pellet resuspended uno y el pellet dos en un nuevo tubo de centrífuga de 1.75 mililitros y vórtice y sonice dos veces en un baño de agua antes de girar los tubos a 400 veces G durante 10 minutos.
Recoja el sobrenadante del tubo centrífugo de 1,7 mililitros y combínalo con el sobrenadante previamente recogido tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros. Filtre el sobrenadante a través de un filtro estéril de membrana PVDF de cinco micrómetros en un nuevo tubo centrífuga de 50 mililitros llamado tubo uno. Agregue un mililitro de VB al tubo centrífugo de 50 mililitros, vaciado después de filtrar el sobrenadante del paso anterior, vórtice, y pásalo a través del mismo filtro de membrana PVDF colocado en el tubo uno.
Pase el filtrado del tubo uno a través de un filtro de membrana MCE estéril de 0,8 micrómetros colocado en un nuevo tubo centrífuga de 50 mililitros llamado tubo dos. Agregue un mililitro de VB al tubo vaciado uno, vórtice, y páse a través del mismo filtro MCE colocado en el tubo dos. Pase el filtrado del tubo dos a través de un filtro PVDF estéril de 0,45 micrómetros colocado en un nuevo tubo centrífuga de 50 mililitros etiquetado como tubo tres.
Como se describió anteriormente, repita el lavado del tubo dos con un mililitro de VB para agregar filtrado al tubo tres. En este análisis representativo, el efecto citopático se podía observar en las células de Vero en 36, 48, y 72 horas de infección del oHSV del poste con el redondeo de las células afectadas. El nivel cada vez mayor de CPE en un cierto plazo es evidente según lo visualizado por la expresión de mCherry.
En 72 horas de infección del poste, las placas virales fueron manchadas con X-gal para visualizar oHSVs con la expresión del lacZ. Limpiar suavemente las células infectadas por el virus y lavar suavemente la parte inferior del matraz es fundamental para mantener intacta todas las células infectadas por el VHS para que se pueda obtener un stock viral de alto título.
