La evaluación de perfiles moleculares en tejidos locales es un paso crítico para comprender el mecanismo de acción de los productos farmacéuticos activos, ya que se evalúan en modelos preclínicos relevantes para la enfermedad. En el campo de la investigación de la artritis, el entorno de tejido local de interés es las pequeñas articulaciones que soportan peso que se componen de una mezcla compleja de hueso, cartílago, músculo, y las células inmunitarias. Aquí describimos un método robusto confiable para la interrupción mecánica y / o pulverización de este entorno de tejido complejo en un entorno controlado criogénicamente.
Este método se puede utilizar para generar esfuerzos de perfilado proteómico y transcripcional aguas abajo para establecer firmas moleculares de la enfermedad a partir de una sola fuente de muestra uniforme. Este método genera un polvo homogéneo a diferencia de muchas otras técnicas antiguas. Además, el antiguo procedimiento de aislamiento de temperatura permite el aislamiento de ARN de alta calidad.
Este método se puede utilizar para generar perfiles proteómicos y transcripcionales posteriores que permitan la caracterización molecular de las vías de interés de la enfermedad relevantes. Este método puede proporcionar información sobre cualquier campo de investigación que esté derivando firmas moleculares de los tejidos. El método podría extenderse a cualquier sistema de tejido complejo que tenga componentes densos y difíciles de disociar.
Aunque no hemos evaluado hasta este punto, podríamos ver una posible aplicación a tejidos de cartílago densos como orejas o huesos. La naturaleza crítica del tiempo de transferir el polvo a tubos para el pesaje es algo que requiere práctica. Si se toma demasiado tiempo, el polvo comenzará a descongelarse y se volverá amorfo.
Es importante limitar el número de muestras a 10 a 15 hasta que se sienta cómodo con el procedimiento. El día del procesamiento del tejido, precanjería todos los instrumentos necesarios sobre hielo seco durante un mínimo de 10 minutos. Use guantes térmicos para evitar ser dañados por el frío extremo.
A continuación, transfiera cada una de las patas de ratón preparadas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros separado y congele inmediatamente en nitrógeno líquido. Almacene las patas congeladas en 80 grados Centígrados negativos. Cuando esté listo para continuar, llene un molino congelador con nitrógeno líquido y déjelo equilibrar durante al menos 10 minutos.
Coloque la muestra sin procesar sobre hielo seco y manténgala allí para evitar ciclos de congelación/descongelación. A continuación, transfiera una pata trasera a un vial de molienda de policarbonato grande pre-refrigerado con un tapón de acero inferior. Inserte el impactador de acero preenfriado y cierre el vial de molienda de policarbonato con el tapón de acero superior preenfriado.
Transfiera los viales de molienda de policarbonato grandes con las muestras al molino del congelador precarido y cierre la tapa con el cierre de goma que se encuentra en la parte delantera del instrumento. Deje que las muestras se enfríen en el nitrógeno líquido durante un minuto. A continuación, ajuste el molino del congelador al programa de un minuto con 10 ciclos por segundo.
Pulse el botón de correr y espere a que el molino del congelador complete su ciclo. Después de esto, abra la tapa del molino del congelador y saque el vial de molienda de policarbonato grande. Coloque el vial de molienda en un extractor y retire el tapón de acero superior colocando presión hacia abajo sobre el mango negro hasta que el tapón de acero se deslice fuera del tubo de policarbonato.
Transfiera el vial de molienda abierto al hielo seco y utilice fórceps preenfriados para eliminar el impactador de acero. Transfiera el polvo congelado a un tubo cónico pre-refrigerado de 50 mililitros. Pesar entre 30 y 50 miligramos de polvo congelado en un tubo de microcentrífuga estratificada de 1,5 mililitros para la extracción de ARN y entre 100 y 200 miligramos para la extracción de proteínas.
Almacene las muestras pulverizadas a 80 grados Celsius negativos y proceda a los aislamientos de ARN y proteínas en un plazo de 24 horas. Primero, agregue 10 microlitros de beta-mercaptoetanol por cada mililitro de tampón RLT. Calcular el volumen de tampón RLT correspondiente a una proporción de 23,3 mililitros por miligramo de tejido y añadir el volumen adecuado de tampón RLT con beta-mercaptoetanol al tubo con polvo congelado.
Vórtice la muestra a 3.000 RPM durante 10 segundos. Utilice una pipeta de un mililitro para pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente 10 veces y vórtice la muestra de nuevo a 3.000 RPM durante 20 segundos. Centrifugar a 13.000 g durante dos minutos y transferir 700 microlitros del sobrenadante a un tubo fresco.
Agregue 700 microlitros de 70% de etanol a este tubo y cargue 700 microlitros de la muestra en una columna de purificación de ARN. Centrifugar el tubo a una velocidad de al menos 10.000 g durante 30 segundos. Deseche el flujo y cargue la parte restante de la muestra en la columna RNeasy y centrifuga el tubo de nuevo a una velocidad de al menos 10.000 g durante 30 segundos.
Deseche el flujo y lave la columna añadiendo 700 microlitros de tampón RW1 y centrifugando al menos la velocidad de 10.000 veces g durante 30 segundos. Si se realiza la opción DNAse digestión, se añaden 350 microlitros de RW1 antes del tratamiento con DNAse. Y después del tratamiento con DNAse, se añaden 350 microlitros adicionales de RW1.
A continuación, lave la columna dos veces añadiendo 500 microlitros de tampón de RPE y centrífuga a una velocidad de al menos 10.000 veces g durante 30 segundos asegurándose de descartar el flujo a través cada vez. Después de esto, seque la columna centrifugando a una velocidad de al menos 10.000 veces g durante dos minutos. Eluda el ARN añadiendo 50 microlitros de agua y centrifugando a una velocidad de al menos 10.000 veces g durante dos minutos.
Recoja el flujo y transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Determinar la cantidad de ARN utilizando el método de elección del investigador y almacenar en negativo 80 grados Celsius antes de un análisis posterior. Diluir la solución de lysis de células 10X a solución de lysis celular 1X con agua de grado de cultivo celular.
Reconstituir el conjunto de cócteles inhibidores de la proteasa uno con un mililitro de agua para hacer un stock inhibidor de la proteasa 100X. Añadir 100 mililitros de inhibidor de la proteasa a 9,9 mililitros de tampón de lisis de células 1X para obtener una solución final de 1X en stock. Agregue cuatro microlitros de tampón de lysis de células heladas por cada miligramo de polvo de tejido y agregue un cordón de acero inoxidable de cinco milímetros al tubo.
Vórtice el tubo a 3.000 RPM durante 60 segundos. Transfiera el tubo al hielo húmedo y continúe con la siguiente muestra. Además, los investigadores pueden encontrar que la colocación de la caja vertical puede facilitar una mejor mezcla con el cordón.
Después de una hora, centrifugar los tubos a 10.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera los sobrenadantes a un tubo fresco asegurándose de evitar la capa de grasa en la parte superior. Determinar la concentración total de proteínas.
Aliquot cada muestra en 1,5 mililitros de microcentrífos de microcentríquel y almacenarlos en 80 grados Celsius negativos hasta que esté listo para realizar análisis posteriores. En este estudio, se utiliza un método de pulverización criogénica para procesar las patas murinas con el fin de mejorar el rendimiento y la calidad del ARN o proteína extraída de los tejidos y permitir el análisis de perfiles moleculares asociados con respuestas inflamatorias. Una visualización representativa de la imagen de gel muestra el ARN extraído de las patas frontales de los ratones de la CIA.
El rRNA 28S y las bandas de ARNr 18S indican que todas las muestras tienen suficiente cantidad de ARN intacto. Aquí se muestra una gráfica de dispersión representativa de las concentraciones totales de proteínas basadas en el análisis de proteína BCA. Las concentraciones totales de proteínas de ratones ingenuos, ratones de la CIA o ratones de la CIA bajo diversos tratamientos son comparables entre grupos.
A continuación, se realizan análisis de Luminex para determinar las concentraciones de citoquinas inflamatorias y quimioquinas en el extracto de proteína. Una gráfica de dispersión representativa de las concentraciones de citoquinas y quimioquinas normalizadas revela que, en comparación con los ratones ingenuos, varias citoquinas se elevan en ratones de la CIA y el tratamiento con anticuerpos anti-IL17A inhibe significativamente la producción de varias citoquinas. El análisis de microarray se realiza para evaluar los cambios en el transcriptoma en la CIA y los efectos relacionados con el tratamiento.
Aquí se muestra una gráfica representativa de los genes de los genes en ratones de la CIA en comparación con los ratones ingenuos. Al realizar este procedimiento, es fundamental que los investigadores minimicen el tiempo que el tubo y el polvo se mantienen fuera del hielo seco. Esto ayuda a prevenir el deshielo del polvo y los problemas posteriores al ARN y la proteína degradados.
La alta calidad de las firmas moleculares generadas por esta técnica permite a los investigadores interrogar el perfil único que una voluntad terapéutica imparte y permite además la diferenciación de los mecanismos que se pueden utilizar para tratar afecciones artríticas. Esta técnica podría utilizarse para extraer una serie de tejidos densos como oídos y huesos para evaluar aún más las firmas moleculares en estos tejidos de interés. Comprender cómo las terapias modulan las firmas moleculares de la enfermedad nos permite evaluar mejor qué vías de señalización específicas se modulan.
Y tal vez aún más importante, qué vías no están reguladas con el mecanismo terapéutico que se evalúa. Cuando se trabaja con nitrógeno líquido y hielo seco, es imperativo utilizar equipos de protección personal, incluidos guantes y protectores faciales debidamente clasificados. La exposición de la piel durante más de unos segundos puede causar quemaduras graves.
Cuando se trabaja con grandes cantidades de hielo seco, es importante trabajar en un área bien ventilada, ya que el hielo seco libera dióxido de carbono.
