Aquí demostramos cómo emplear el sensor FRET sensible a ATP ATeam 1.03 YEMK para mediciones dinámicas de los cambios en los niveles neuronales y astrocíticos de ATP en sectores organotípicamente cultivados del hipocampo del ratón. La principal ventaja de esta técnica es que se puede estudiar el metabolismo energético en el tejido cerebral vivo en un entorno controlado, un entorno con altos niveles de expresión de sensores. Esta técnica puede ayudar a obtener información sobre los pathomecanismos, enfermedades subyacentes o daño cerebral, por ejemplo, causado por la privación de energía, como el accidente cerebrovascular isquémico.
Se puede, en principio, se puede utilizar para estudiar los niveles de ATP, no sólo en el tejido cerebral, pero en otros órganos, así. Para ejecutar con éxito este experimento, es esencial realizar todos los pasos involucrados en el cultivo del tejido extremadamente cuidadoso y mantener la esterilidad. Además, se requiere cierto conocimiento de la imagen fluorescente celular.
El manejo de tejidos en el enfoque más sofisticado y una visualización es vital para entender los procedimientos adecuados. Lo mismo ocurre con los experimentos de diagnóstico por imágenes. Demostrando el procedimiento estarán Rodrigo Lerchundi, un postdoctorado, y Na Huang, un estudiante de maestría del laboratorio.
En un plato de Petri helado lleno de ACSF, coloque el cerebro sobre una membrana de filtro. Separe los hemisferios y realice un corte parasagittal en un ángulo de 45 grados. Fije un hemisferio en la etapa del tejido Vibratome con superpegamento, e inmediatamente transfiera el bloque de tejido al baño Vibratome que contiene ACSF helado burbujeado con 5% de dióxido de carbono y 95%oxígeno.
Alinee el tejido en el baño Vibratome. Mantenga el segundo hemisferio en ACSF helado hasta cortarlo. Ajuste el Vibratome para cortar rodajas a 250 a 400 micrómetros.
Después de cortar la rebanada, identificar la formación del hipocampo en función de su aspecto morfológico típico y aislarlo utilizando agujas hipodérmicas, manteniendo la parte de la corteza cerebral adyacente al hipocampo. Coloque la rebanada sobre una malla en ACSF, calentada a 34 grados Celsius y burbujeada con 5% de dióxido de carbono y 95%oxígeno hasta que se recojan todas las rodajas. Transfiera las rodajas al armario de flujo laminar para continuar en condiciones estériles.
Con una pipeta Pasteur de vidrio invertido y estéril, transfiera suavemente las rodajas del ACSF a uno de los platos Petri precalegados llenos de solución estéril de sal de Hanks. Cambie la pipeta y transfiera las rodajas al segundo plato de cultivo. Repita el proceso cinco veces en general.
Transfiera el menor HBSS posible a las siguientes placas de cultivo. Con una pipeta, coloque suavemente una rebanada a la vez en la parte superior del inserto de cultivo. Evite las turbulencias en la pipeta y espere hasta que la rebanada descienda hasta la punta de la pipeta Pasteur.
Repita el proceso para cada sector. Coloque dos rodajas en una membrana. Retire cuidadosamente cualquier exceso de solución Hank de la parte superior de la plaquita usando una punta fina.
Mantenga los cultivos en una incubadora humidificada en 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados hasta el día del experimento. Reemplace el medio cada dos o tres días. Sin tocar el tejido, aplique 0,5 microlitros del vector diluido directamente en la parte superior de cada rodaja.
Finalmente, vuelva a colocar las rodajas en la incubadora y mantenlas allí durante al menos seis días más. Justo antes de comenzar un experimento, transfiera un inserto que contenga rodajas cultivadas en la capucha estéril y colóquelo en un plato de 30 milímetros que contenga un mililitro de medio de cultivo de rodajas organotípicas, o medio esencial mínimo. Coloque el plato debajo del estereoscopio y concéntrese en la superficie de la rebanada.
Utilice dos agujas hipodérmicas estériles para hacer un corte cruzado corto justo en los bordes estrechos de una rebanada elegida, y en la capa superior sin dañar el tejido debajo. Para eliminar la rebanada preparada de la plaquita, sostenga los bordes de la membrana con pinzas y utilice un bisturí estéril para hacer cortes rectos y paralelos a la membrana, formando un cuadrado o un triángulo con la rebanada en el centro. Si el inserto aloja rodajas adicionales, transfiérelos de vuelta a la placa original y a la incubadora.
La tensión superficial del medio evitará su fuga sobre la superficie de la membrana. Preparar ACSF experimental y obtener un pH de 7,4 burbujeándolo con 95%oxígeno y 5% de dióxido de carbono a través de un tubo insertado conectado al suministro de carbógeno durante al menos treinta minutos. Mantenga la solución salina burbujeada durante todo el experimento.
A continuación, encienda la fuente de luz fluorescente del monocroma. Transfiera el cultivo de la rebanada organotípica a la cámara experimental. Coloque una rejilla en la parte superior del cultivo organotípico de la rebanada con el marco hacia abajo, sin tocar el cultivo, y los hilos hacia arriba, tocando la membrana.
Coloque la cámara en la etapa del microscopio y conéctela al sistema de perfusión. Encienda la bomba peristáltica a un caudal de 1,5 a 2,5 mililitros por minuto. Asegúrese de que no haya fugas del sistema de perfusión.
Usando la luz de transmisión, ponga la rebanada cultivada en el foco e identifique el área donde se realizarán los experimentos. Antes de iniciar los experimentos de diagnóstico por imágenes, espere al menos 15 minutos para permitir que las rebanadas se adapten a las condiciones salinas y, a continuación, encienda la cámara y el software de imágenes. Excite la proteína fluorescente del donante a 435 nanómetros.
Establezca el tiempo de exposición en entre 40 y 90 milisegundos. A continuación, inserte el espejo dicroico y los filtros en la unidad divisora de viga. Divida la emisión de fluorescencia en 500 nanómetros con un divisor de imagen de emisión y utilice filtros de paso de banda a 482 más o menos 16 y 542 más o menos 13,5 nanómetros para aislar aún más la fluorescencia de donantes y aceptadores.
Seleccione una región de interés aparentemente carente de fluorescencia celular para la resta de fondo. Círculo de estructuras individuales de tejido etiquetado en la imagen en la pantalla para crear ROI. Establezca la frecuencia de adquisición de imágenes y el tiempo total de grabación.
Para experimentos de más de 30 minutos, se recomienda una frecuencia de adquisición de 0,2 a 0,5 hercios para evitar la fototoxicidad. Posteriormente, inicie la grabación. Para inducir cambios en el ATP intracelular, cambie el tubo de perfusión del ACSF estándar a una solución salina que contenga inhibidores metabólicos, por ejemplo, solución de isquemia química.
Alternativamente, utilice una solución salina con una concentración elevada de potasio a ocho mililitros para imitar la liberación de iones de potasio de las neuronas activas. Directamente después de las grabaciones, intercambie el ACSF experimental con el ACSF con montones-buffered. A continuación, transfiera la cámara de grabación que contiene el cultivo de la rebanada al microscopio de escaneo láser confocal.
Tome imágenes de pila Z con la resolución Z más alta posible en la configuración óptica dada. En este protocolo, diez días después de una transducción, las neuronas que expresaban ATeam 1.03 YEMK se encontraron a alta densidad en el neocórtex de las rebanadas de tejido cultivada a profundidades de hasta 50 micrómetros por debajo de la superficie de la rebanada. Se lograron resultados comparables en el hipocampo.
Para los astrocitos, ATeam 1.03 YEMK se expresó bajo el control del promotor de proteínas ácidas fibrolares gliales humanas, y las rodajas organotípicas que expresan ATeam 1.03 YEMK en las neuronas del hipocampo crujas seleccionadas LOS ROI representan los somatas de las células piramidales. Después de exponer la rebanada a 5 alzida sódica milimétrica en ausencia de glucosa extracelular durante un minuto, se indujeron cambios opuestos en la intensidad de emisión del par FRET. También se observó una disminución reversible en la relación ATeam FRET.
La relación ATeam FRET a largo plazo en 14 células diferentes en condiciones basales en neuronas y astrocitos muestra que el ATeam es un sensor confiable y estable. Tenga en cuenta que la isquemia química resultó en la fuerte caída esperada en la proporción de ATeam en ambos tipos de células al final de este experimento. Un aumento en la concentración extracelular de potasio de tres a ocho milimolar durante tres minutos no resultó en un cambio detectable en las neuronas que expresan ATeam 1.03 YEMK.
Por el contrario, los astrocitos reaccionaron al aumento del potasio extracelular por un aumento reversible en la relación ATeam FRET, lo que indica un aumento en los niveles intracelulares de ATP. Una vez más, la isquemia química causó una disminución inmediata en la relación de ATeam, demostrando que el sensor puede detectar cambios en ATP. Al intentar imágenes celulares basadas en FRET como se describe aquí, es importante tener en cuenta que la producción de rebanadas de alta calidad en cultivos organotípicos es un paso clave.
Además, se requiere una eliminación cuidadosa de la cicatriz glial y de las imágenes a nivel experto. Después de este procedimiento, uno también debe ser capaz de realizar experimentos que incorporan diferentes otros nanosensores basados en FRET para metabolitos celulares. Por ejemplo, los de glucosa o lactato.
Por último, pero no menos importante, es necesario subrayar que siempre deben observarse los actos pertinentes de protección de los animales. Esto también es cierto para las leyes efectivas que rigen el manejo de organismos modificados genéticamente.
