We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

Declaración de Ética Animal: Los protocolos descritos en este manuscrito siguen las directrices de cuidado animal establecidas por la Universidad de Auckland y la Universidad de Stanford. P7 crías de rata fueron sacrificados por decapitación rápida. La disección del hipocampo se realiza entonces inmediatamente como se describe a continuación. 1. organotípicos del hipocampo rebanada Cultura <ol><li> Preparación <ol><li> Preparar el medio de disección (sólo se utiliza para diseccionar el cerebro). Combinar 200 ml de medio esencial mínimo, 2 ml de solución de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de cada uno, en 0,85% de NaCl), 5 ml de solución tampón de HEPES, 2 ml de solución madre 1 M Tris (pH 7,2), y esterilizar por filtración con filtro de 0,22 micras . Llevar a cabo la disección del hipocampo en medio de disección en frío de hielo. </li><li> Enfriar el medio de disección. Coloque la disección de los medios de comunicación en el congelador aproximadamente 1 hora antes de comenzar la disección hasta que el líquido es muy frío. No permita que gran cr hieloystals para formar. Almacenar en hielo hasta que se necesite. </li><li> Preparar el medio de cultivo (utilizado para todo, excepto la disección de hipocampos). Combinar 100 ml de medio mínimo esencial, (concentración 1x, líquido) w / sales de Hank, W / L-glutamina, 2 ml de solución de penicilina-estreptomicina (líquido, 10.000 unidades de cada uno, en 0,85% de NaCl), 2,5 ml de HEPES 1 M de tampón solución, 50 ml solución salina equilibrada de Hank, 50 ml de suero de caballo (definida, inactivado por calor), y esterilizar por filtración con filtro de 0,22 micras. </li><li> Preparar las placas de cultivo. Coloque 1 ml de medios de cultivo por 35 mm placa de cultivo, y añadir un inserto de membrana para cada plato. Ponga hasta siete de estos platos en una placa de Petri de 150 mm (en lo sucesivo como un &#39;plato&#39;). Colocar la placa en una incubadora de CO 2 durante al menos una hora antes de la disección comienza de modo que el medio de cultivo en los platos alcanza la temperatura y pH adecuado. </li></ol></li><li> La disección de los hipocampos de rata cachorros en Postnatal Día 7 (P7) <ol><li> Pre-esterilizar todas las herramientas de disección con luz UV antes del procedimiento. </li><li> Después de la decapitación rápida, retire el cerebro y el lugar en un medio frío en un plato, y luego retírela con un trozo de papel de filtro humedecido para la disección. Se burlan de la corteza lejos del cerebro medio usando espátulas lisas contundentes recubiertos de plástico en miniatura, dejando al descubierto el hipocampo. Corte el fondo de saco, y luego trabajar suavemente la espátula debajo del hipocampo para voltear hacia fuera (Figura 1A). NOTA: El éxito de cultivos de corte se pueden preparar usando animales hasta P10. </li><li> Recorte el hipocampo aislado lejos del resto del cerebro. Transferir el hipocampo en un nuevo plato que contiene los medios de comunicación disección fría utilizando un pincel suave humedecido (por ejemplo, blanco sable # 4). </li><li> Limpiar la parte inferior (es decir, el lado más plano) del hipocampo de plexo coroideo durante la disección, ya que estos tejidos esponjosos,-meninge como hacen difícil separar del hipocamporebanadas entre sí más adelante. NOTA: Deje estos tejidos en su lugar si no pueden ser objeto de burlas de distancia con cuidado. </li><li> Realizar toda la disección tan rápidamente como sea posible sin dañar los hipocampos. NOTA: Una cuidadosa disección es más importante que uno rápido, siempre y cuando se enfrían las condiciones experimentales. Cortar los hipocampos de tres ratas simultáneamente. La salud rebanada no se ve afectada, siempre y cuando el tiempo total desde el principio hasta cuando las rebanadas chapados entran en la incubadora tiene menos de 30 min. </li></ol></li><li> Rebanar <ol><li> Cortar los hipocampos transversalmente en 400 micras secciones transversales utilizando una máquina de cortar el tejido manual. El método por el cual se lleva a cabo el corte no es importante, siempre y cuando no sea demasiado perjudicial para el tejido y produce rebanadas de espesor consistente con la arquitectura laminar fácilmente visible (es decir, el cuerno de Ammon se ve fácilmente que se conserva en el tejido). </li><li> Lie los hipocampos en el escenario del tejidochopper en la parte superior de un espesor triple # 2 de papel de filtro. El hipocampo se cortó por completo sin necesidad de retirar algún segmento individual (es decir, todo el hipocampo se deja en la escena del helicóptero hasta que se hayan hecho todos los cortes, sino como hogazas de pan de molde en este punto; Figura 1B). </li><li> Transfiera los hipocampos en medio de disección utilizando un pincel suave relajado al lado de cada hipocampo (blanco sable # 2). Empujar suavemente cada hipocampo a un lado para romper la adhesión entre el hipocampo y el papel de filtro subyacente. Enrolle el cepillo debajo de cada hipocampo a recogerlo fuera del escenario. Coloque todos los hipocampos en la misma 35 mm placa de Petri de medio de disección fría. Separar los hipocampos en rodajas individuales agitando manualmente el plato en la alternancia de movimientos en sentido horario y antihorario. </li><li> Inspeccione las rebanadas con un microscopio de disección y descartar cualquier que se daña, pequeña, o que no poseen células claramente visiblecapas del cuerpo. NOTA: A menudo será el caso de que no todas las rebanadas se separan con éxito de sus hermanos de esta manera. En este caso, se pueden separar girándolas en el borde y empujando con la punta de unas pinzas finas. &quot;Buenas&quot; cortes se transfieren a otra placa de Petri que contenía medio limpio disección fría utilizando una cortada y pulida al fuego pipeta Pasteur (figuras 1C-E). </li></ol></li><li> Almacenamiento <ol><li> Coloque las rebanadas individuales en los elementos filtrantes de membrana. Con una pipeta Pasteur cortada y pulida al fuego para dar una luz mayor, transferir individualmente rebanadas a los insertos de cultivo. NOTA: El tamaño del agujero creado al cortar y es importante la pipeta-pulido fuego. Demasiado pequeño y las rodajas no dejarán fácilmente la pipeta para la membrana. Fluido demasiado grande y el exceso se coloca en la superficie de la membrana junto con la rebanada. La mejor diámetro del agujero es típicamente de alrededor de la mitad del diámetrotro del cilindro de la pipeta. Al cortar, este diámetro puede ser elegido por el corte en el lugar adecuado sobre el cono de la pipeta. </li><li> Rodaja de transferencia <ol><li> Llenar la pipeta con el medio, y luego aspirar una sola rebanada con pequeñas fuerzas de succión. Esto mantiene la porción cerca de la abertura de la pipeta y evita demasiado expulsión medio en el inserto para colocar la rebanada. </li><li> Aplique una ligera presión en el bulbo para formar una pequeña gota colgante, permita que el segmento se asiente en esa gota, y luego toque que gota a la membrana y dejar que el sector &quot;caída&quot; sobre la membrana. Generalmente tres rebanadas se colocan en cada inserción de membrana. NOTA: Si la gotita de líquido es demasiado grande, las gotitas procedentes de los tres rodajas tienden a fusionarse en la superficie de la membrana, y las rodajas se reúnen para así todo el centro de la membrana, lo que hace más difícil separarlas para registro electrofisiológico más tarde. </li></ol></li><li> Remov Fluidal <ol><li> Aspirar el medio sobrante de la parte superior del inserto de placa de cultivo para todos los sectores en que la placa (3 rebanadas por inserto = 21 rebanadas por placa), de modo que las rebanadas no están sumergidos en o rodeados por una piscina de medio de disección. </li><li> Realice esto es con un sin cortar, pero pipeta Pasteur pulida al fuego. Deje que la rebanada se asiente y se adhieren a la membrana por un minuto antes de pipetear. Tenga cuidado de no aspirar la rebanada en la pipeta. Llevar a cabo la eliminación de líquido para las inserciones que se sembraron en primer lugar, para que haya tiempo suficiente para que las rodajas se asienten. </li></ol></li><li> Rodaja de almacenamiento <ol><li> Cultivos de corte tienda en un incubador de CO2 un 5,0% a 37 ° C. Observar la disposición final de las culturas en la figura 1E. Las rodajas individuales descansan sobre un inserto de placa de cultivo que tiene una membrana porosa por un fondo, y este inserto encaja dentro de una placa de Petri llena con una pequeña cantidad de medio; por este medio, las rebanadas no están inmersos en el meDium, pero tiene acceso a ella sólo a través de la membrana en la parte inferior del inserto de placa de cultivo. </li><li> Opcionalmente, puede eliminar las rodajas de estudio, ya sea mediante la eliminación de la inserción de placa de cultivo o mediante la reducción de una sección de la membrana inserto que contiene una rebanada. </li></ol></li></ol></li><li> Mantenimiento <ol><li> Cambie el medio de las placas de Petri el día después de hacer las culturas. Transferir el inserto de placa de cultivo a una nueva placa de Petri que contiene 1 ml de medio de cultivo fresco que se equilibra en la incubadora durante al menos una hora antes de la transferencia. </li><li> Cambiar el medio de nuevo de la misma manera en el tercer día después de hacer las culturas. En el tercer día, transferir las culturas a una incubadora a 34 ° C. Cambie el medio dos veces por semana (cada 3-4 días). </li><li> Identificar los cultivos sanos. Seleccione culturas saludables para grabaciones de células enteras pareadas. NOTA: Los cultivos sanos tienen un borde bien definido y una capa de células piramidales claramente definido. Culturas ingenioh oscuro (probablemente necrótico) áreas o presente un aspecto vacuolado con bordes aplanados son rechazadas. El empleo de estos criterios, generalmente de dos tercios de los cultivos de cortes son lo suficientemente saludable para la grabación. </li><li> Utilizar estas culturas dentro de una bastante pequeña ventana de tiempo. No tejidos utilizados que son cultivadas durante más de dos semanas desde que las neuronas comienzan a mostrar un comportamiento ligeramente epileptiforme que empeora lentamente con el tiempo. El límite superior exacto de la supervivencia neuronal no se conoce, pero es posible grabar de funcionamiento de las células piramidales tan tarde como 16 semanas en cultivo. </li></ol></li></ol> 2. pareadas grabaciones de células enteras <ol><li> ACSF y Soluciones intracelulares <ol><li> Preparar la solución de electrodo presináptica mezclando (en mM) 120 gluconato de potasio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, y 0,3 NaGTP (pH 7,2 con KOH; osmolaridad: 290 mOsm). Mientras que la misma solución de electrodo se utiliza para las neuronas postsinápticas, gluconato de cesio (120 mM) Se utiliza típicamente como la sal importante en el electrodo postsináptica, además de 5 mM QX314. NOTA: Esto permite fijación de tensión estable a potenciales positivos para registrar corrientes NMDAR mediada postsinápticos 8-10,13. También evita que la hiperexcitabilidad inducida por potasio de la neurona presináptica por la solución interna que fluye desde el electrodo de registro postsináptica antes de que se hizo un sello ohmios giga. </li><li> Preparar la solución de electrodo postsináptica componer (en mM) 120 gluconato de cesio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP, y 0,3 NaGTP (pH 7,2 con CsOH; osmolaridad: 290 mOsm). Tire de microelectrodos de vidrio a 5-10 resistencia mW y rellenar con solución interna filtrada. </li><li> Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) componer (en mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO 4, 2,4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO3, 11 de glucosa, pH 7,4, saturado con 95% O 2, 5 % de CO 2. NOTA: Si r AMPAR mediadaesponses necesitan ser bloqueado para el examen de NMDAR EPSCs, incluyen 10 M CNQX o NBQX en la ACSF. </li></ol></li><li> Obtener emparejado enteros Grabaciones celulares <ol><li> Para examinar la transmisión sináptica entre dos neuronas individuales, designar una neurona como la neurona presináptica y mantenga en la pinza de corriente para inducir potenciales de acción e iniciar la transmisión sináptica. </li><li> Designe la segunda neurona, como la neurona postsináptica, y mantenerlo en su pinza de corriente o voltaje en función de la información requerida por el investigador. Obtener un examen detallado de las corrientes glutamatérgicas, con EPSCs mediados por AMPAR examinados a -65 mV y EPSCs NMDAR mediada examinados en 30 mV 6-16 mediante la celebración de la neurona postsináptica de fijación de voltaje </li><li> Establecer una grabación emparejado. Establecer una grabación emparejado, la grabación de células completas presináptica se obtiene siempre primero, lo que permite múltiples neuronas postsinápticas secuenciales para obtener hasta uno que es sinápticamente connectese obtiene d. Si la realización de experimentos de plasticidad sináptica, es especialmente crítica para obtener la neurona presináptica primera como la inducción de LTP en la neurona postsináptica debe iniciarse dentro de los 10 min de la obtención de células enteras las grabaciones para evitar el lavado de los factores citoplásmicos necesarios para LTP 8,19. </li><li> Evitar la pérdida de células inducida por el movimiento-. Un reto importante al realizar grabaciones de células enteras pareadas es evitar la vibración y la interrupción inducida movimiento-de la primera grabación de células enteras, mientras que la obtención de la segunda grabación. <ol><li> Obtener la primera grabación de células enteras y luego mover el microscopio lente 10-200 micras en el eje x de manera que el registro establecido se encuentra en el borde de la zona visible en el monitor (Figura 2A). </li><li> Elevar la lente del microscopio ~ 5-10 mm garantizando al mismo tiempo que la ACSF todavía mantiene contacto con la lente. Monte el segundo electrodo y guiar en el menisco de líquido (Figura 2B </strong&gt;). </li><li> Mueva el electrodo en el plano xy hasta que esté directamente debajo de la trayectoria de la luz a través del objetivo, pero todavía muy por encima del electrodo de registro establecido. Una vez que el electrodo es visible bajo el microscopio, asegurar la punta está en el borde más alejado de la monitor lejos del primer electrodo. </li><li> Mueva el segundo electrodo hacia abajo en secuencia con el foco del microscopio hasta que ambos electrodos están en el mismo plano focal. Es importante que el nivel de presión positiva es lo suficientemente fuerte para evitar el bloqueo punta pero no demasiado fuerte como para perturbar la primera grabación de células enteras. Esto se traduce en la presión positiva inducir movimiento en 2-3 neuronas del electrodo cuando entra primero la rebanada. </li><li> Localizar un socio postsináptica en un plano focal similar a la primera grabación presináptica (Figura 2C). Grabación generalmente obtener grabaciones entre las neuronas piramidales CA3 el segundo conjunto de células emparejado de una neurona 0-200 mm de la primera rrabación (Figuras 2C, D). NOTA: La transmisión sináptica entre pares neuronales son estables durante periodos de tiempo de hasta 3-4 horas cuando se utilizan estas técnicas de grabación de células enteras normalizadas. </li></ol></li></ol></li><li> La plasticidad sináptica: Érase obtener un éxito par de células piramidales conectado sinápticamente-3A (figuras, B), examinar las características de la transmisión sináptica y la plasticidad. <ol><li> Inducción de LTP. <ol><li> Inducir LTP por el emparejamiento de los potenciales de acción presináptica (1 Hz) con la despolarización postsináptica a -10 a 0 mV durante 1 min (Figura 3C) 7-9,12-14. Inicia la vinculación dentro de 10 minutos de rodaje a la neurona postsináptica. NOTA: LTP también puede ser inducida con ambas neuronas celebradas en pinza de corriente por el emparejamiento de los potenciales de acción presinápticos y postsinápticos a 1 Hz durante 1 min, con potenciales de acción postsináptica suscitó 10 mseg después de la inyección de la corriente en la neurona presináptica 8 </sarriba&gt;. </li></ol></li><li> Además inducir LTD por estimulación de baja frecuencia (EPA) a 1 Hz en combinación con una ligera despolarización de la neurona postsináptica a -55 mV durante 5-10 minutos (Figura 3 C) 9. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+in+the+induction+of+long-term+potentiation+and+depression+of+synaptic+excitation+between+hippocampal+CA3-CA1+cell+pairs+in+vitro.">Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).</li><li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+enhancement+shown+by+whole+cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices.">Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).</li><li>DeBello, W. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+variability+in+quantal+size+in+cultured+hippocampal+neurons+and+hippocampal+slices.">Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).</li><li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons:+quantal+levels,+oscillations,+and+LTP.">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li><li>Debanne, D., Gu&#233;rineau, N. C., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures.">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li><li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn,+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down's+syndrome.">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Aquí hemos descrito los requisitos para establecer exitosas grabaciones de células enteras pareadas en cultivos de cortes de hipocampo organotípicos. Grabaciones apareadas también se pueden realizar en múltiples preparaciones, incluso en lonchas agudas y sistemas de cultivo disociadas 26,27. Mientras que el enfoque aquí ha estado en la inducción de formas de plasticidad sináptica (LTP y LTD saber) más largos, es importante destacar que las grabaciones de células enteras pareadas en organotípico, re...

Los receptores de glutamato median la mayoría de la transmisión sináptica excitadora en las sinapsis del sistema nervioso central. Los dos subtipos principales de receptores ionotrópicos de glutamato localizados en la cabeza de la columna vertebral de la membrana postsináptica son N-metil-D-aspartato (NMDA) y α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico ácido (AMPA). En reposo los potenciales de membrana, receptores AMPA llevan la mayor parte de la corriente postsináptica durante la transmisión sináptica. En el hipocampo, el receptor de NMDA juega un papel clave en el desencadenamiento de los cambios en el número de receptores AMPA en la membrana postsináptica: al actuar como un &quot;detector de coincidencia&quot; 1 para iniciar los cambios en la fuerza sináptica 1, el receptor de NMDA participa en los mecanismos sinápticos que se cree que subyacen en el aprendizaje y la memoria en un nivel subcelular. En respuesta a la despolarización de la neurona postsináptica en paralelo con la liberación del transmisor presináptica, el calcio entra a través de la NMDAreceptor para iniciar la inserción del receptor de AMPA o extracción 2. Estas dinámicas de los receptores de la plasticidad subyacen sinapsis: un aumento en la fuerza sináptica es la potenciación a 2,3 largo plazo (LTP), mientras que una disminución en la fuerza sináptica es la depresión a largo plazo 4 (LTD). Por lo tanto el movimiento del receptor de AMPA se piensa que es responsable de la expresión de la plasticidad sináptica, mientras que los receptores de NMDA se cree que el control de su inducción. La determinación de los mecanismos precisos que subyacen a la transmisión sináptica y la plasticidad requiere el estudio de pequeñas poblaciones de sinapsis, idealmente sinapsis individuales. Mientras que algunas sinapsis son muy adecuados para el estudio a este nivel, por ejemplo, el cáliz de Held 5, para las poblaciones más sinápticas esto es extremadamente difícil debido a la naturaleza pequeña y difusa de las conexiones sinápticas. Dos de las principales técnicas de electrofisiología se han desarrollado para examinar las conexiones sinápticas individuales: El primero es la estimulación mínima, where una fibra presináptica se presume estimulada extracelularmente. La segunda técnica se combina grabaciones, donde se lleva a cabo dos grabaciones simultáneas de células enteras de neuronas conectadas sinápticamente. Una ventaja importante de estimulación mínima es que es rápida y relativamente fácil de realizar, que implica la colocación de un electrodo de estimulación extracelular en el tracto axonal mientras que simultáneamente se grabe de una neurona postsináptica. La principal preocupación cuando se utiliza esta técnica es que la estimulación fiable de una única célula rara vez se puede garantizar prueba tras prueba. Durante los últimos quince años hemos utilizados habitualmente se combina grabaciones de células enteras a partir de dos neuronas piramidales conectados sinápticamente 6-17. La principal ventaja de esta técnica es que sólo una neurona presináptica es estimulada consistente y fiable. También permite no sólo la caracterización electrofisiológica, sino también la manipulación farmacológica de la neurona presináptica 6,18 &lt;/ Sup&gt;. Sin embargo, la probabilidad de conectividad sináptica entre neuronas es baja, por lo que los pares conectados difícil obtener 19. El uso de cultivos de cortes de cerebro organotípicos evita este obstáculo como la conectividad sináptica puede volver a establecer in vitro y, además, la naturaleza de la conectividad resultante es similar a la que en el tejido cerebral nativa 20. Además, cultivos organotípicos expresan LTP, LTD 7-10,12-15,21 y otras formas de plasticidad sináptica a corto plazo, incluyendo la facilitación a dos pulsos (PPF) y la depresión (PPD) 6,22,23, lo que permite a los mecanismos de plasticidad ser estudiado en pares de neuronas. Aquí se describe la metodología detallada que participan en la consecución con éxito grabaciones pareadas en este sistema in vitro. Esta información puede ser fácilmente adaptado para otros sistemas experimentales, incluso en lonchas agudas y otras regiones del cerebro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Organotypic cultures</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:64px;">Paired recordings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable motorized micromanipulators&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shallow tissue bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DIC camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M Tris stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic-coated miniature spatulas&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">soft paintbrush&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Data acquistion and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manual tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrode puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#2 filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5&#160; forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane inserts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CO2 incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Conectividad sináptica es evidente mediante la estimulación de la neurona presináptica para disparar un potencial de acción por el que pasa un impulso de corriente de despolarización (típicamente 20-50 Pa durante 20 mseg) a través del electrodo de registro. La traza actual postsináptica se examina para detectar la presencia de un EPSC monosináptico evocado en corto (&lt;5 ms) y latencias consistentes después del pico del potencial de acción presináptica (Figura 3A). En la mayoría de los exp...

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Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K vistas.  University of Auckland. Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Video: Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Emparejados grabaciones patch clamp de neurona motora y el músculo esquelético de destino en el pez cebra

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Investigación

Neurociencias

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotípicos culturas rebanada hipocampo

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Culturas de rebanada Hippocampal Organotypic como un modelo para estudio neuroprotección e invasividad de las células tumorales

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.