Para caracterizar completamente un fenotipo microglial, es importante abordar la motilidad basal y direccional. Este protocolo se puede utilizar para probar la motilidad direccional de la microglia mediante imágenes de dos fotones en rodajas cerebrales de ratones, utilizando cámaras de impresión 3D personalizadas y cámaras de perfusión. Demostrando el procedimiento estarán Fanny Etienne, estudiante de doctorado, y Vincenzo Mastriolia, investigador postdoctoral, ambos de nuestros laboratorios.
Al menos 30 minutos antes de la disección, empezar a burbujear 70 mililitros de líquido cefalorraquídeo artificial colina, o colina aCSF, en hielo. Añadir 150 mililitros de colina aCSF a 32 grados Celsius, con carbógeno. Coloque un plato cristalizante de 200 mililitros con un imán de barra en una caja de alimentos sellada y agregue 200 mililitros de aCSF al plato.
Coloque un soporte de rebanada de interfaz impreso en 3D en la parte superior del plato y retire el exceso de líquido de la placa cristalizante, hasta que sólo quede una fina película de solución que cubra la malla del portaobjetos de interfaz. Agregue unos milímetros de aCSF en la parte inferior de la caja de alimentos y comience a burbujear el líquido con carbógeno. A continuación, cierre la caja sellada mientras mantiene la carbogenación constante para crear una cámara de interfaz humidificada, 95%oxígeno y 5%rica en dióxido de carbono.
Después de la cosecha, coloque el cerebro en un pedazo de papel de filtro empapado en aCSF y diseccione la región de interés, de acuerdo con el ángulo preferido de corte. Para las rodajas coronales, coloque y pegue la cara caudal del cerebro en un plato de Petri de 10 centímetros unido al bloque de corte de una cortadora vibratoria, y coloque el bloque en la cámara del depósito de la cortadora vibratoria dentro de una cámara grande llena de hielo. Llene el plato con aCSF de colina helada y use la cortadora para obtener rodajas cerebrales de 300 micrómetros de espesor, usando una pipeta de transferencia desechable de cuatro milímetros de diámetro después de cada pasada de la hoja para recoger cada rebanada.
Deje que cada rebanada se recupere en el 32 grados Celsius colina aCSF durante unos 10 minutos después de que se obtiene, antes de transferir las rodajas en trozos de papel de limpieza de la lente, cubierto con una gota de colina aCSF. A continuación, aspirar el exceso de colina aCSF y utilizar una espátula para transferir las rebanadas en la malla de la cámara de interfaz, permitiendo que las rebanadas se recuperen en este entorno durante al menos 30 minutos. 30 minutos antes de iniciar la grabación, conecte la bomba peristáltica a una cámara de grabación personalizada con perfusión superior e inferior para optimizar la oxigenación y viabilidad de las rodajas de tejido, y limpie todo el sistema de perfusión con 50 mililitros de agua ultrapura.
Al final del ciclo de limpieza, inicie la perfusión de la cámara de grabación con 50 mililitros de aCSF en un vaso de precipitados de vidrio bajo carbogenación constante, y utilice una pipeta desechable de transferencia de boca ancha para transferir la primera rebanada a ser imagen al vaso de precipitados para retirar el papel de la lente. Cuando la sección se haya hundido en la parte inferior del vaso de precipitados, transfiera la sección a la cámara de grabación y coloque el soporte de la rebanada en la rebanada para minimizar el movimiento inducido por el flujo de perfusión. Usa la iluminación de campo brillante para apuntar a la región cerebral de interés bajo un aumento de cinco a 10 veces.
A continuación, utilice un objetivo de 25x con una lente de inmersión en agua de 0,35x para ajustar la posición del campo de visión. Utilice la iluminación de fluorescencia para localizar las células microgliales fluorescentes y rellenar la pipeta con 10 microlitros de aCSF que contienen el compuesto de interés en su concentración final. Apunte la punta hacia abajo con un suave temblor para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la punta y monte la pipeta llena en un soporte de pipeta conectado a una jeringa de cinco mililitros con el émbolo colocado en la posición de cinco mililitros y montado en un micromanipulador de tres ejes.
Baje la pipeta suavemente hacia la rebanada, controlando y ajustando el objetivo al mismo tiempo, hasta que la punta de la pipeta toque ligeramente la superficie de la rebanada. Ahora afina el láser y cambia el microscopio al modo multifono. Asegúrese de que la cámara esté filtrada desde cualquier fuente de luz y encienda los detectores no predefinidos.
Establezca la ganancia y utilice una tabla de búsqueda con un límite superior codificado por colores para evitar saturar los píxeles de la imagen. A continuación, comience a grabar durante una duración total de al menos 30 minutos, presionando lentamente el émbolo de la jeringa de la posición de cinco a un mililitro, después de cinco minutos, durante un período de cinco segundos, para aplicar el compuesto a la sección. Para el análisis de imágenes, primero realice la proyección z y la corrección de deriva con ImageJ en el archivo de interés.
A continuación, abra el archivo modificado en Icy y dibuje una región circular de 35 micrómetros de diámetro de interés, centrada sobre el lugar de inyección. Ejecute la película de nuevo con el ROI, para asegurarse de que está bien posicionada. A continuación, utilice el plugin de evolución de la intensidad de la región de interés para medir la intensidad media a lo largo del tiempo en la región de interés, y guarde los resultados como un archivo xls.
Este protocolo permite medir las respuestas inducidas por diferentes compuestos, como ATP o serotonina. Aunque la inyección de ATP provoca un aumento de la fluorescencia, después de la mayoría de las inyecciones de ATP, hay una disminución inmediata, leve en la fluorescencia debido a la distorsión del tejido que vuelve después de unos minutos. El tamaño de la región de interés también afecta a la cuantificación, ya que el aumento del diámetro reduce la variabilidad entre los experimentos, pero disminuye la precisión y magnitud de la respuesta detectada.
La evaluación de la respuesta microglial en un momento específico puede ser útil para la comparación estadística de diferentes compuestos, o para probar los efectos de antagonistas específicos añadidos a la solución de perfusión. Para cuantificar la motilidad en tres dimensiones, sepa que puede tener que cambiar el intervalo del paso z y la tasa de muestreo de la adquisición para que se ajuste a los requisitos de análisis.
