Este protocolo permitió el desarrollo de modelos de cáncer de cabeza y cuello con operación genómica específica, lo que impactó significativamente en nuestra comprensión del papel de mutaciones genéticas específicas en el proceso de neoplasia. La principal ventaja de esta técnica es la facilidad con la que la línea celular se puede desarrollar desde prácticamente cualquier órgano. Demostrando el procedimiento estará Manu Prasad un estudiante de posgrado de mi laboratorio.
Comience por usar tijeras quirúrgicas para cosechar la lengua de un ratón transgénico B6 macho o hembra de seis semanas de edad. Utilice un bisturí para picar el tejido en fragmentos muy pequeños y recoger las piezas en un tubo de 15 mililitros que contiene 4,5 mililitros de RPMI medio simple sin suero. Añadir 200 microlitros de mezcla de triple enzima al tubo e incubar la muestra a 37 grados Celsius durante 30 minutos tocando el tubo cada 10 minutos para mejorar la disociación enzimática del tejido.
Al final de la incubación, detenga la reacción con 5%FBS en PBS y filtre la suspensión celular a través de un colador de malla de 70 micro metros para separar las células de los fragmentos de tejido más grandes. Recoger las células por centrifugación y volver a suspender el pellet en tres mililitros de medio completo. Luego platina las células en tres mililitros de medio completo por plato de 16 milímetros.
Transfiera los agregados de celda retenidos en la parte superior del filtro a una placa de cultivo separada de 16 milímetros y agregue tres mililitros de medio completo. Mantenga ambos platos en la incubadora hasta que se forme colonias celulares distintas. Después de una semana de cultivo, examine microscópicamente los cultivos celulares primarios en busca de la presencia de contaminación por fibroblastos, tratando las células con 25%tripínsa en 02%EDTA a 37 grados Celsius durante un minuto, y elimine cualquier fibroblastos.
En el día 10 del cultivo utilizan 25%trypsin en 02%EDTA durante tres a cinco minutos a 37 grados Celsius para cosechar las células de la suspensión celular o cultivos de agregado celular y ver dos veces 10 a las quintas células primarias en dos mililitros de medio por pozo en cada pozo de la placa de 6 pozos. Al día siguiente transducir las células con un uno por 10 a los 12 genomas virales por mililitro e incubar las células en el medio que contiene partículas virales durante 48 horas a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, reemplazar los sobrenadantes de cultivo con dos mililitros de medio fresco completo por pozo y devolver las células a la incubadora de cultivo celular.
Después de dos semanas de expansión del cultivo, sembrar las células para la validación y experimentos tumorigénicos in vivo. Utilizando el vector AAV CAS9, se ha determinado de 10 a 12 genomas virales por mililitro de virus para transformar eficientemente las células primarias de metanfetamina en mapas tumorigénicos utilizando el protocolo como se ha demostrado. Las células transducidas Express Cre, CAS9 y Proteína Fluorescente Verde.
La inyección de cinco veces 10 al quinto AAV primario transdujo mapas en la lengua, labio y piel de ratones NOD SCID, resulta en la formación de tumores en estos animales a diferencia de la inyección de mapas primarios, que no inducen tumores. La transformación tumorigénica de las células epiteliales de la lengua primaria se puede confirmar mediante inmunofluorescencia e hinchazón occidental. El análisis genómico mediante la secuenciación profunda del ADN, aislado de las células transformadas, confirma la edición eficaz de genes y el cambio de fotogramas de los genes de proteína tumoral 53 y APC por el sistema AAV CAS9.
Además, las células de la lengua transformadas forman eficientemente tumores en seis ratones negros de tipo salvaje C57. El análisis inmunohistoquímico de las células tumorales neoplásicas revela la expresión citoplásmica de E-Cadherin y Keratin 14, ambos marcadores de tejido epitelial. Al intentar este procedimiento, recuerde siempre que demasiada picadura o demasiada reacción enzimática conducen a una menor viabilidad de las células, lo que conduce a una menor eficiencia de las transacciones de virus.
Usando este procedimiento, las líneas celulares pueden ser modificadas genéticamente para obtener información sobre el potencial tumorigénico y metastásico de las células cancerosas de cualquier tejido de interés.
