Los protocolos presentados aquí han sido optimizados para la cultura 3D y permiten una investigación eficiente y asequible de los procesos asociados con el crecimiento de las células cancerosas, la proliferación y la muerte en un entorno 3D. Las principales ventajas de utilizar el cultivo 3D es que son una posibilidad única para recapitular aspectos clave del microambiente tumoral in vitro. El esferoide 3D es una herramienta importante para la detección de fármacos contra el cáncer, que se utiliza cada vez más para mejorar la traducción entre condiciones in vitro e in vivo en la investigación de la terapia oncológica.
Algunos de los protocolos requieren una cierta cantidad de práctica y habilidad. Esto es especialmente cierto para la producción de esferoides por el método de gota manual, y para la incrustación de esferoides para la inmunohistoquímica. Como los elementos clave de estos procedimientos son difíciles de describir por escrito, como cómo insertar esferoides en una gota de agarosa, la demostración visual ayudará a los investigadores a realizar estos procedimientos.
Diluir la suspensión celular preparada en un tubo de 15 mililitros para obtener la densidad celular óptima. Transfiera la suspensión celular diluida a un depósito estéril y utilice una pipeta multicanal para dispensar 200 microlitros en la placa previamente preparada. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un 95% de humedad.
Cada dos o tres días, adquiere imágenes microscópicas ligeras de los esferoides. Después de adquirir las imágenes, retire 100 microlitros del medio gastado de cada pozo, y reemplácelo por 100 microlitros de medio fresco. En primer lugar, descongelar la membrana del sótano reconstituido sobre hielo.
Mantenga las placas y depósitos envueltos individualmente sobre hielo antes de usarlos. A continuación, diluya la suspensión celular preparada en un tubo de 15 mililitros para obtener la densidad celular óptima. Coloque el tubo que contiene la suspensión celular diluida sobre hielo.
Llene los recipientes de plástico con hielo y transfiéralos a la capucha. Transfiera las placas y depósitos refrigerados a una campana de cultivo celular. Coloque las placas y los depósitos de nuevo sobre hielo.
Resuspender el rBM suavemente para asegurar un gel homogéneo. Añadir la concentración óptima del rBM a las suspensiones de células refrigeradas. Invierta el tubo para asegurarse de que el rBM y la suspensión celular se mezclan correctamente.
A continuación, transfiera esta mezcla a un depósito estéril y utilice una pipeta multicanal para dispensar 200 microlitros a cada pozo de una placa refrigerada de ultra-baja fijación, de 96 pozos. Centrifugar la placa a 750 veces g durante 15 minutos para asegurarse de que las células se agrupan cuando el rBM se endurece. Utilice el descenso suave centrífugo o la función de frenado mínimo.
Primero, agregue seis mililitros de PBS a un plato de cultivo celular. Diluir la suspensión celular preparada para obtener una dilución adecuada. Una dilución práctica es de 50.000 células por mililitro.
Vierta la suspensión celular en un depósito estéril y utilice una pipeta multicanal para colocar cuidadosamente hasta 30 gotas de suspensión en la tapa de la placa de cultivo celular, lo que resulta en una concentración de 2000 células por gota. En un movimiento rápido pero controlado, invierta la tapa y colóquela encima del plato de cultivo celular que contiene PBS. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un 95% de humedad durante cuatro a seis días.
Si los esferoides se van a utilizar para los analios de proteínas o incrustación, tire de ellos quitando la tapa, inclinándola, y luego lavando las gotas con un mililitro de medios calentados. Transfiera el medio que contenga esferoides resultante a un tubo de 1,5 mililitros. Deje que el esferoide se asiente en la parte inferior del tubo antes de proceder con los lysates proteicos o la incrustación.
Corte el extremo de una punta de pipeta P200 para capturar más fácilmente los esferoides sin alterar su estructura. Para cada condición, tire de un mínimo de 12 pero idealmente entre 18 y 24 esferoides en un tubo de 1,5 mililitros. Coloque los tubos sobre hielo y deje que los esferoides se asienten en la parte inferior.
A continuación, pase del laboratorio de células estériles al laboratorio regular. Lavar los esferoides dos veces en un mililitro de un X PBS helado, asegurándose de dejar que los esferoides se asienten antes de eliminar el PBS entre cada paso de lavado. Luego, aspirar tanto PBS como sea posible sin molestar o quitar los esferoides.
Añadir cinco microlitros de tampón de lelisis calentada con inhibidores de fosfatasa y proteasa por esferoide. Vórtice los esferoides durante 30 segundos y luego realice una centrifugación rápida durante 10 segundos. Repita estos intervalos de vórtice y centrifugación durante cinco a 10 minutos, o hasta que los esferoides se disuelvan.
Después de preparar la solución PI, retire 100 microlitros de medio de cada pozo en la placa de 96 pozos, asegurándose de no quitar los esferoides. Añadir 100 microlitros de un X PBS calentado a cada pozo, seguido de la eliminación de 100 microlitros de líquido de los pozos. Repita este paso de lavado tres veces para lavar cualquier medio restante.
A continuación, añada 100 microlitros de la solución PI a cada pozo. Cubra la placa en papel de aluminio e incubar durante 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad durante 10 a 15 minutos. Después de esto, repita el proceso de lavado con un X PBS calentado tres veces, como se describió anteriormente, para lavar la solución pi de pi y disminuir la señal de fondo al tomar imágenes.
Usando un microscopio de epifluorescencia, imagine las esferoides. En el software de imágenes, abra el menú multicanal. Establezca el tiempo de exposición para los canales relevantes y pulse Configuración de lectura después de ajustar cada canal.
Abra el menú Z-stack y defina el inicio y el final ajustando el enfoque de la imagen. Inicialmente tener el esferoide fuera de foco, luego mover el punto focal a través de todo el esferoide hasta que la imagen se vuelva borrosa una vez más. A continuación, ajuste el tamaño del paso para que esté entre 18 y 35 micrómetros y pulse Iniciar.
Para empezar, fije los esferoides en una campana de humos en el primer día como se describe en el protocolo de texto. En el segundo día, coloque el gel de agarosa en un vaso de precipitados lleno de agua en un horno microondas para calentarlo y mantener el gel caliente en una placa de calentamiento de sobremesa ajustada a 60 grados centígrados, hasta que sea necesario. Lave los esferoides dos veces en la campana de humos usando un mililitro de un PBS X por lavado.
Entonces, aspira la mayor parte del PBS. Prepare una punta de pipeta de 20 microlitrotro cortándola en una pendiente para obtener una punta más puntiaguda con un agujero más grande. Después de esto, haz una gota de gel de agarosa en un portaobjetos del microscopio.
Coloque el portaobjetos sobre un bloque calefactor caliente para evitar que la agarosa se solidifice. Usando la punta de pipeta modificada, capture tantos esferoides como sea posible en un volumen de 15 a 20 microlitros. Inyecte cuidadosamente los esferoides en el centro de la gota de gel de agarosa, asegurándose de no tocar la diapositiva del microscopio.
Incubar a temperatura ambiente o a cuatro grados durante cinco a 10 minutos para dejar que el gel de agarosa se endurezca. Cuando la gota de gel se haya solidificado un poco, pero todavía es bastante suave, usa un bisturí para empujarlo cuidadosamente desde el portaobjetos del microscopio en un cassette de tejido plástico. Transfiera el cassette de tejido a un vaso de precipitados lleno de etanol y guárdelo a temperatura ambiente.
En este estudio, se presentan una serie de métodos para el análisis de los cambios inducidos por el tratamiento contra el cáncer en la viabilidad de las células cancerosas y la muerte en el cultivo 3D. La concentración de rBM añadida puede afectar profundamente la morfología de los esferoides. La adición de hasta 2.5%RBM permite la formación de esferoides en las células de cáncer de mama SKBr-3, sin ningún efecto adicional a concentraciones más altas.
Por el contrario, las células cancerosas pancreáticas BxPC-3 forman espontáneamente pequeños esferoides compactos. En este tipo de célula, el aumento del rBM a 1,5% o superior provoca un cambio morfológico distinto de esferoide a estructuras más enrevesadas con protuberancias e invaginaciones. Un ejemplo del uso de cultivos esferoides para el cribado de la eficacia de la quimioterapia se muestra aquí.
Las imágenes del microscopio de luz se adquieren cada dos o tres días durante un experimento de respuesta a la dosis realizado para determinar la dosis necesaria para una viabilidad reducida del 50% en las células de cáncer de mama MDA-MB-231. La disposición espacial de las células muertas tras una concentración creciente de un inhibidor se puede visualizar mediante tinción PI. Como se ve, los esferoides de control muestran un núcleo apoptótico tardío y necrótico limitado, mientras que las células muertas se distribuyen por todo el esferoide a medida que aumenta la concentración de inhibidor.
La técnica de esferoide que se muestra aquí se puede aplicar a muchos otros ensayos, como invasión 3D, migración o análisis microforético. También es aplicable para los co-cultivos con fibroblastos, adipocitos, o células inmunitarias, que pueden proporcionar información importante sobre las interacciones celulares en el microambiente tumoral. El desarrollo de esta técnica ha sido muy importante para esclarecer el papel del microambiente tumoral en numerosos aspectos del desarrollo del cáncer, incluyendo la expresión génica, la invasión y la asistencia para el tratamiento.
