Este protocolo permite el montaje dirigido por la información de secuencias oligoméricas mediante interacciones covalentes dinámicas, imitando verdaderamente la hibridación selectiva de secuencias de ácidos nucleicos pero con una mayor resistencia a la unión entre los participantes. Los ensamblados covalentes dinámicos normalmente se restringen a arquitecturas simples debido a su capacidad limitada para la reorganización de enlaces y la corrección de errores. Por el contrario, al elevar a lo largo de la concentración de un ácido Lewis para afectar la disociación de la unión y posteriormente catalizar el reordenamiento de la unión, esta técnica mitiga las limitaciones prevalentes de captura cinética de los sistemas de autoensamble.
Este método podría emplearse en una variedad de campos que utilizan reacciones de reorganización de enlaces covalentes, desde marcos orgánicos covalentes con tasas de defectos excepcionalmente bajas hasta interfaces de tejido biomaterial que son capaces de adaptarse y acomodar la remodelación continua del sustrato tisular. Al realizar esta técnica por primera vez, los individuos pueden encontrar ensamblajes atrapados kineticamente incluso después de tiempos de recocido prolongados. Aconsejamos a los usuarios por primera vez que intenten hibridaciones entre oligómeros que llevan exclusivamente residuos de aldehído y exclusivamente aminas, simplificando la información codificada y, por lo tanto, la hibridación.
Para comenzar este procedimiento, pese 0,125 gramos de resina de soporte sólido fotolabile FMOC y agréguela a un recipiente de reacción de sintetizador automatizado frito. Inserte el recipiente en la parte de microondas del sintetizador. Llene la botella principal de disolvente con DMF y el frasco de desprotección con una solución de 20%4-methylpiperidina en DMF y vacíe los residuos.
A continuación, preparar una solución molar de ácido bromoacético y DIC en DMF con volúmenes totales de 1,5 mililitros para cada residuo en secuencia y 0,47 mililitros de anhídrido acético a 4,53 mililitros de DMF para hacer una solución de tapado de cinco mililitros. Preparar 0.5 soluciones molares de cada amina primaria que se utilizará en NMP. El volumen total de cada solución debe ser de 2,5 mililitros para cada residuo de la amina primaria adecuada más 2,5 mililitros adicionales.
Añada todas las soluciones al colector de sintetizador automatizado. Usando un sintetizador de péptido automatizado, hincha la resina, corta el grupo FMOC y realiza la reacción de desplazamiento como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, salinizar las paredes de un recipiente de reacción de vidrio frito equipado con un tapón de tres vías llenándolo hasta la parte superior con una solución de 5%diclorodimethylsillane en DCE.
Dejar reposar durante 30 minutos y luego drenar el recipiente y lavarlo con DCE y metanol. Después de que el recipiente esté seco, transfiera la resina a él. Lave la resina tres veces con DCM utilizando cinco mililitros para cada lavado mientras burbujea con gas nitrógeno a través de un brazo y tirando del vacío con otro.
Secar y almacenar la resina y el oligopeptoid adjunto hasta la desprotección y escote. Cuando esté listo para continuar, vuelva a hinchar la resina si se ha almacenado durante más de un día burbujeándola con cinco mililitros de DMF durante 10 minutos. Escurra el recipiente y agregue una pequeña barra de agitación magnética y tres mililitros de DCM seco al recipiente de péptido de vidrio.
Pesar 0,1 equivalentes del catalizador de paladio y 25 equivalentes de fenilalolado por grupo de anto. Utilice una abrazadera para colocar el recipiente de reacción en un ángulo por encima de la placa de agitación de modo que la resina se someta a una agitación suave mientras permanece suspendida en el disolvente y tapone el recipiente para evitar que el DCM se evapore. Después de una hora, filtre la solución y lave la resina tres veces con DCM con cinco mililitros por lavado.
Luego, repite la desprotección del asignación una vez más. A continuación, enjuague la resina secuencialmente con metanol y DCM dos veces y transfiera la resina y la barra de agitación magnética a un vial de 20 mililitros. Sumerja la resina en DMF, revuelva y corte como se describe en el protocolo de texto.
A continuación, utilice un filtro de jeringa para separar el oligopeptoid liberado de la resina y retire el disolvente al vacío. Reconstituir los peptoides en una mezcla de 50-50 de agua y acetonitrilo y purificar con HPLC preparativo de fase inversa. Combine las fracciones purificadas, luego congele y liofilízalas para producir un polvo blanquecino.
Analice el polvo con espectrometría de masas ESI y MALDI. Para evaluar la pureza, realice hpLC analítica de los oligopeptoides purificados. En primer lugar, preparar 10 soluciones de stock mililar de cada secuencia oligopeptoid utilizada para el autoensamble y una solución de 10 mililitros de triflato de scandium en acetonitrilo anhidro.
Añadir 20 microlitros de cada solución de material peptoide a un vial de tres mililitros equipado con una barra de agitación magnética. Añadir 1,5 equivalentes de la solución de triflado de scandium por unión potencial de amina de la solución de stock y añadir suficiente agua y acetonitrilo para formar 200 microlitros de una solución de 2% de agua y acetonitrilo. Revuelva suavemente a 70 grados centígrados durante dos horas para la desprotección de acetil del aldehído y la disociación de todas las hebras.
Después de esto, cargue el vial con 200 microlitros de cloroformo y dos mililitros de agua. Agitar suavemente el vial. Deje reposar la mezcla durante al menos 15 minutos.
Tras una separación de fase completa, extraiga la capa orgánica con una jeringa de microlitro. Transfiera la capa orgánica a un vial nuevo y revuelva a 70 grados Celsius para el recocido de oligómeros que normalmente toma seis horas. Para demostrar la capacidad de los peptoides codificados con información para someterse a un autoensace covalente dinámico selectivo de secuencia en escaleras moleculares, se sintetiza e hibrida una hebra representativa con su secuencia peptoide complementaria.
Los monómeros NPAM y NPAL se emplean como pares de reactivos covalentes dinámicos con NEEE ayudando a la solubilidad de los productos finales autoensamblados. Una vez completada la síntesis de submonómeros de fase sólida, se elimina el grupo de asignación. Antes y después de la desprotección, partes de la resina se cortaron por debajo de 405 nanómetros de luz y se caracterizaron por espectrometría de masas de ionización de electrospray.
La secuencia es purificada por preparación de HPLC, luego liofilizada para lograr un polvo blanquecino y la pureza se confirma con HPLC analítico. El oligopeptoid se hibrida posteriormente con su secuencia complementaria para permitirse una escalera en el registro confirmada por MALDI-MS. Al realizar este procedimiento, recuerde dejar suficiente tiempo para que las capas se separen completamente hasta que la fracción acuosa se vuelva transparente, al menos 15 minutos para garantizar la extracción suficiente del catalizador.
Después de completar este procedimiento de ensamblaje, se debe realizar la espectrometría de masas para determinar el alcance de la hibridación. Además, se puede utilizar la espectrometría de masas plasmáticas acoplada inductivamente o la RMN de flúor para evaluar la concentración de escandadio después de la extracción. Si bien esta técnica se desarrolló recientemente, anticipamos que el enfoque biomimético descrito en nuestro trabajo será fundamental para dirigir el diseño futuro y el montaje dirigido a la información de nanoestructuras complejas.
Varios de los reactivos utilizados aquí son peligrosos. Tenga cuidado al manipular estos o cualquier otro producto químico. Use todo el equipo de protección personal y realice todos los experimentos dentro de una campana de humos.
