Dieses Protokoll ermöglicht die informationsgesteuerte Montage oligomerer Sequenzen durch dynamische kovalente Wechselwirkungen, die die sequenzselektive Hybridisierung von Nukleinsäuren wirklich imitieren, aber mit erhöhter Interstrandbindungsfestigkeit. Dynamische kovalente Baugruppen sind aufgrund ihrer begrenzten Kapazität für Bond-Rearrangement und Fehlerkorrektur in der Regel auf einfache Architekturen beschränkt. Im Gegensatz dazu mildert diese Technik durch die Erhöhung entlang der Konzentration einer Lewis-Säure, um die Bindungsdissoziation zu beeinflussen und anschließend die Bindungsumlagerung zu katalysieren, die vorherrschenden kinetischen Fangbeschränkungen der Selbstmontagesysteme.
Diese Methode könnte in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt werden, die kovalente Bond-Rearrangement-Reaktionen nutzen, von kovalenten organischen Gerüsten mit außergewöhnlich niedrigen Fehlerraten bis hin zu biomaterialgewebeschnittstellen, die in der Lage sind, sich anzupassen und die weitere Umgestaltung des Gewebesubstrats zu ermöglichen. Bei der ersten Ausführung dieser Technik können Individuen kinetisch gefangene Baugruppen auch nach längeren Glühzeiten finden. Wir raten Erstanwendern, Hybridisierungen zwischen Oligomeren zu versuchen, die ausschließlich Aldehyd und ausschließlich Aminrückstände tragen, wodurch die kodierten Informationen und damit die Hybridisierung vereinfacht werden.
Um dieses Verfahren zu beginnen, wiegen Sie 0,125 Gramm FMOC photolabile Feststoffträgerharz und fügen Sie es zu einem gefritted automatisierten Synthesizer Reaktionsgefäß. Setzen Sie das Gefäß in den Mikrowellenteil des Synthesizers ein. Füllen Sie die Hauptlösungsmittelflasche mit DMF und die Deprotection-Flasche mit einer Lösung von 20%4-Methylpiperidin in DMF und entleeren Sie den Abfall.
Als nächstes bereiten Sie eine Mollösung von Bromessigsäure und DIC in DMF mit einem Gesamtvolumen von 1,5 Millilitern für jeden Rückstand in der Reihenfolge und 0,47 Milliliter essiges Anhydrid auf 4,53 Milliliter DMF vor, um eine Fünf-Milliliter-Verschließlösung herzustellen. Bereiten Sie 0,5 Molarenlösungen jedes primären Amins vor, das in NMP verwendet werden soll. Das Gesamtvolumen jeder Lösung sollte 2,5 Milliliter für jeden Rückstand des entsprechenden Primäramins plus zusätzliche 2,5 Milliliter betragen.
Fügen Sie alle Lösungen zum automatisierten Synthesizer-Verteiler hinzu. Mit einem automatisierten Peptid-Synthesizer, das Harz anschwellen, spalten Sie die FMOC-Gruppe, und führen Sie die Verschiebungsreaktion, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach die Wände eines gefranstglasigen Reaktionsgefäßes mit einem Drei-Wege-Stopphahn zu salzen, indem Sie es nach oben mit einer Lösung von 5% Dichlorodimethylsilan in DCE füllen.
Lassen Sie es für 30 Minuten sitzen, dann das Gefäß abtropfen lassen und mit DCE und Methanol waschen. Nachdem das Gefäß trocken ist, das Harz auf sie übertragen. Waschen Sie das Harz dreimal mit DCM mit fünf Millilitern für jede Wäsche, während sie mit Stickstoffgas durch einen Arm sprudeln und Vakuum mit einem anderen ziehen.
Trocknen und lagern Sie das Harz und das beigefügte Oligopeptoid bis zum Detektion und Dekolleté. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, das Harz erneut anschwellen lassen, wenn es länger als einen Tag gelagert wurde, indem Sie es mit fünf Millilitern DMF für 10 Minuten sprudeln. Entleeren Sie das Gefäß und fügen Sie dem Glaspeptidgefäß einen kleinen magnetischen Rührstab und drei Milliliter trockenes DCM hinzu.
Wiegen Sie 0,1 Äquivalente des Palladiumkatalysators und 25 Äquivalente Phenylsilan pro Alloc-Gruppe. Verwenden Sie eine Klemme, um das Reaktionsgefäß in einem Winkel über der Rührplatte so zu positionieren, dass das Harz eine sanfte Rührung durchläuft, während es im Lösungsmittel aufgehängt bleibt, und das Gefäß verkapseln, um eine Verdunstung des DCM zu verhindern. Nach einer Stunde die Lösung abfiltern und das Harz dreimal mit DCM mit fünf Millilitern pro Waschgang waschen.
Wiederholen Sie dann noch einmal den Alloc-Deprotection. Als nächstes spülen Sie das Harz zwei Mal sequenziell mit Methanol und DCM ab und übertragen sie in eine 20-Milliliter-Durchstechflasche. Untertauchen Sie das Harz in DMF, rühren und spalten Sie, wie im Textprotokoll beschrieben.
Verwenden Sie dann einen Spritzenfilter, um befreites Oligopeptoid vom Harz zu trennen und das Lösungsmittel unter Vakuum zu entfernen. Die Peptoide in einem 50-50-Gemisch aus Wasser und Acetonitril rekonstituieren und mit umgekehrten Phasenpräparativen HPLC reinigen. Kombinieren Sie die gereinigten Fraktionen, dann einfrieren und lyophilisieren sie, um ein off-white Pulver zu ergeben.
Analysieren Sie das Pulver mit ESI- und MALDI-Massenspektrometrie. Um die Reinheit zu bewerten, führen Sie analytische HPLC der gereinigten Oligopeptoide durch. Bereiten Sie zunächst 10 Millimolar-Lagerlösungen jeder Oligopeptoidsequenz für die Selbstmontage und eine 10 Millimolar-Stammlösung von Scandiumtriflat in wasserfreiem Acetonitril vor.
Fügen Sie 20 Mikroliter jeder Peptoid-Stammlösung zu einer Drei-Milliliter-Durchstechflasche hinzu, die mit einem magnetischen Rührbalken ausgestattet ist. Fügen Sie 1,5 Äquivalente der Scandium-Triflate-Lösung pro potentiellen Aminbindung aus der Stammlösung hinzu und fügen Sie genügend Wasser und Acetonitril hinzu, um 200 Mikroliter einer 2%Wasser- und Acetonitrillösung zu bilden. Bei 70 Grad Celsius zwei Stunden lang vorsichtig umrühren, um das Aldehyd zu deprotektormen Acetyl zu erhalten und alle Stränge zu dissoziieren.
Danach die Durchstechflasche mit 200 Mikroliter Chloroform und zwei Milliliter Wasser aufladen. Schütteln Sie die Durchstechflasche vorsichtig. Lassen Sie die Mischung für mindestens 15 Minuten stehen.
Nach vollständiger Phasentrennung die organische Schicht mit einer Mikroliterspritze extrahieren. Die organische Schicht in eine neue Durchstechflasche geben und bei 70 Grad Celsius rühren, um oligomer zu glühen, was in der Regel sechs Stunden dauert. Um die Fähigkeit von informationscodierten Peptoiden zu demonstrieren, sequenzselektive dynamische kovalente Selbstmontage in molekulare Leitern zu durchlaufen, wird ein repräsentativer Strang synthetisiert und mit seiner komplementären Peptoidsequenz hybridisiert.
Die Monomere NPAM und NPAL werden als dynamische kovalente Reaktantenpaare eingesetzt, wobei NEEE die Löslichkeit der fertigen selbst zusammengesetzten Produkte unterstützt. Nach Abschluss der Solid-Phase-Submonomersynthese wird die Alloc-Gruppe entfernt. Vor und nach dem Deschutz wurden Teile des Harzes unter 405 Nanometer Leichtwasser zerknirscht und durch Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie charakterisiert.
Die Sequenz wird durch Prep HPLC gereinigt, dann lyophilisiert, um ein off-white Pulver zu erreichen und die Reinheit wird mit analytischem HPLC bestätigt. Das Oligopeptoid wird anschließend mit seiner komplementären Sequenz hybridisiert, um sich eine von MALDI-MS bestätigte Registerleiter zu leisten. Denken Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens daran, genügend Zeit für die vollständig getrennten Schichten einzuplanen, bis die wässrige Fraktion transparent wird, mindestens 15 Minuten, um eine ausreichende Katalysatorextraktion zu gewährleisten.
Nach Abschluss dieses Montageverfahrens sollte eine Massenspektrometrie durchgeführt werden, um das Ausmaß der Hybridisierung zu bestimmen. Zusätzlich kann induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie oder Fluor-NMR verwendet werden, um die Scandiumkonzentration nach der Extraktion zu bewerten. Während diese Technik vor kurzem entwickelt wurde, gehen wir davon aus, dass der in unserer Arbeit beschriebene biomimetische Ansatz entscheidend dazu beitragen wird, die zukünftige Gestaltung und informationsgesteuerte Montage komplexer Nanostrukturen zu lenken.
Einige der hier verwendeten Reagenzien sind gefährlich. Bitte seien Sie vorsichtig, wenn Sie mit diesen oder anderen Chemikalien umgehen. Tragen Sie alle persönlichen Schutzausrüstungen und führen Sie alle Experimente in einer Dunstabzugshaube durch.
