Los autores desean agradecer al Sr. Michael Connolly y Dr. Ronald Zuckermann (la fundición Molecular, laboratorio nacional Lawrence Berkeley) ayuda de la técnica en la síntesis de peptoid. Reconocemos el apoyo de la National Science Foundation (-1301505). Todos los experimentos de espectrometría de masas se llevaron a cabo en las instalaciones de espectrometría de masa química en la Universidad del Pacífico.

1. síntesis de Peptoid
Nota: La síntesis comienza con la activación de la resina por la hinchazón de la resina y eliminar el grupo de protección. Esto es seguido por crecimiento de la cadena de peptoid en la resina a través de la repetición de ciclos de la adición de monómero. El primer monómero juntado a la resina es el residuo c-terminal. El peptoid es alargado de la terminal C a la N-terminal. Una vez lograda la secuencia deseada de la peptoid, la resina es troceada apagado y se purifica el producto peptoid.
<ol><li>Preparación de los reactivos Nota: Los reactivos líquidos se miden utilizando una micropipeta y los reactivos sólidos se miden utilizando una balanza analítica.<ol>
<li>6,2 ml de N, N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) y 43,8 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) para preparar un 0,8 M de solución DIC/DMF.</li>
		<li>Disolver 5,56 g de BMA en 50,0 mL de DMF para preparar una solución de M BMA/DMF 0,8.</li>
		<li>Mezclar 2 mL de piperidina (Pip) y 8 mL de DMF para lograr la solución al 20% Pip/DMF.</li>
		<li>Disolver 1.9 mL de Npe a 13,1 mL de DMF para alcanzar 1.0 M Npe/DMF.</li>
		<li>Disolver 1,3 mL de Nme en 13,7 mL DMF para alcanzar 1.0 M Nme/DMF.</li>
		<li>Disolver 0,32 mL de Nae en 2 mL de DMF para alcanzar 1.0 M Nae/DMF. PRECAUCIÓN: La mayoría de los productos químicos utilizados en la síntesis es peligrosa. Ácido trifluoroacético (TFA), DIC, Pip y BMA son peligrosos para la piel, ojos y vías respiratorias. DMF y diclorometano (DCM) son sospechosos cancerígenos. Todas las reacciones deben realizarse en una campana de humos y debe usarse equipo de protección personal. Por favor revise la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) de todos los productos químicos utilizados en la síntesis.</li>
	</ol></li>
	<li>Activación de resina
	<ol>
<li>Mida 84 mg de resina amida de pista (resina, 0.047 mmol, carga de 0,56 mmol/g) y añadir a un recipiente de la reacción de fase sólida polipropileno de 10 mL. Inserte el émbolo en el recipiente.</li>
		<li>Añadir 2 mL de DMF en el recipiente de la reacción y tapa el recipiente con una tapa de presión. Coloque el vaso en un agitador y agitar el recipiente a temperatura ambiente en un ángulo de movimiento de aproximadamente 12 grados y 385 oscilaciones/min durante 30 min drenaje la solución a un recipiente retirar la tapa y empujando el émbolo del recipiente de reacción.</li>
		<li>Añadir 2 mL de solución al 20% Pip/DMF al recipiente y la tapa el recipiente. Agitar en el agitador por 2 min y drenar la solución para el depósito de residuos.</li>
		<li>Añadir 2 mL de solución al 20% Pip/DMF al recipiente, el recipiente, la tapa y agitar a temperatura ambiente durante 12 min., retire la tapa y vaciar la solución para el depósito de residuos.</li>
		<li>Lavar la resina mediante la adición de 1 mL de DMF, tapado el recipiente y agitar el recipiente durante 1 minuto sacar el tapón y vaciar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina con DMF para 4 veces adicionales.</li>
	</ol></li>
	<li>Además del monómero y la acetilación N-terminal Nota: Cada ciclo de la adición de monómero implica desplazamiento, bromoacetylation y reacción de dos pasos.<ol>
<li>Llevar a cabo el primer ciclo de adición de monómero para formar Nme-resina.</li>
		<li>Llevar a cabo una reacción de bromoacetylation. Mezclar 1 mL de solución M BMA/DMF 0,8 y 1 mL de 0,8 M DIC/DMF solución en un vaso de precipitados. Transferir la mezcla a un recipiente de reacción que contienen resina y tapa el recipiente. Coloque el vaso en el agitador y agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos Retire la tapa y vaciar la solución para el depósito de residuos.</li>
		<li>Lavar la resina por agregar 1 mL de DMF, tapado el recipiente, agitar durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina por agregar 1 mL de DCM, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución. Lavar la resina con DCM una vez más y luego lavar dos veces con DMF.</li>
		<li>Llevar a cabo una reacción de desplazamiento. Añadir 1 mL de 1,0 solución de M Nme/DMF, tapa el recipiente, agitar el recipiente a temperatura ambiente durante 60 minutos Retire la tapa y vaciar la solución empujando el émbolo.</li>
		<li>Lavar la resina agregando 1 mL DMF, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina en 1 mL de DCM, agitando durante 1 minuto, y drenar la solución. Lave el DCM una vez más, seguido de lavado dos veces con DMF.</li>
		<li>Repetir ciclos de adición de monómero de pasos 1.3.2 a 1.3.5 formar Nae-(Npe-Nme)4-resina. Cuando repitiendo el paso de la reacción de desplazamiento (1.3.4), utilice una solución de Amina específicos según la secuencia peptoid. Nota: La cadena peptoid es alargada de la terminal C a la N-terminal con el residuo c-terminal a la resina.</li>
		<li>Realizar la acetilación N-terminal para formar Ac-Nae-(Npe-Nme)4-resina.</li>
		<li>Anhídrido acético Mix 92 μl of, 43.5 μl de N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) y 2 mL de DMF en un vaso de precipitados para hacer aproximadamente 2 mL de la acetilación de cóctel.</li>
		<li>Añadir 2 mL de acetilación cóctel al recipiente que contiene resina, tapa el recipiente y agitar a temperatura ambiente por 60 min., retire la tapa y vaciar la solución empujando el émbolo.</li>
		<li>Lavar la resina por agregar 1 mL de DMF, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina por agregar 1 mL de DCM, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución. Repita el lavado de la resina con DCM una vez más, luego lavado con DMF dos veces más.</li>
		<li>Lavar la resina por agregar 1 mL de DCM, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Repetir el lavado dos veces con DCM. Retire la tapa y deje que la resina seque al aire en el recipiente de reacción durante 10 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Escote y purificación
	<ol>
<li>Mezclar 3,8 mL de TFA, 100 μl de Triisopropilsilano (consejos) y 100 μl de grado HPLC H2O en un vaso de precipitados para hacer 4 mL de escote cocktail.</li>
		<li>Añadir 4 mL de recién hechos escote cóctel al recipiente que contiene la resina, tapa el recipiente y agitar a temperatura ambiente durante 2 h.</li>
		<li>Retire la tapa y recoger la solución de filtrado en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL. Añadir 1 mL de TFA al recipiente, tápalo y agitar durante 1 minuto recoge la solución de filtrado en el mismo tubo de centrífuga.</li>
		<li>Soplando en una corriente de gas nitrógeno suavemente hasta aproximadamente 1 mL solución viscosa se deja evaporar la TFA.</li>
		<li>Añadir 15 mL de éter etílico a la solución restante, tapa el tubo de centrífuga e incube en un congelador de-20 ° C por 2 h para toda la noche. El peptoid crudo precipita como sólido blanco.</li>
		<li>Pellet sólido utilizando una centrífuga a 4.427 x g durante 10 minutos Retire la tapa del tubo de centrífuga y decantar el éter dietílico en un vaso de precipitados con cuidado sin perder el sólido. PRECAUCIÓN: el éter dietílico es un solvente orgánico inflamable. Utilice una centrifugadora seguro de éter dietílico.</li>
		<li>Lave el sólido añadiendo 10 mL de éter dietílico helado en la centrifugadora del tubo que contiene el sólido, tapado el tubo y colocarlo en la centrífuga. Realizar la centrifugación a 4.427 x g durante 10 minutos Retire la centrifugadora del tubo de la centrífuga y decantar el éter dietílico en un vaso de precipitados con cuidado sin perder el sólido.</li>
		<li>Secar el sólido soplando suavemente en una corriente de gas nitrógeno.</li>
		<li>Añadir 10 mL de grado HPLC H2O para disolver el sólido seco. Pasar la solución a través de un filtro de jeringa de nylon con tamaño de poro de 0.45 μm y recoger el filtrado en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL previamente ponderada.</li>
		<li>Cáscara de congelar la solución colocando y rotando el tubo de centrífuga que contiene la solución de peptoid en 12 onzas, doble-apilan ampliada poliestireno taza 1/3 lleno con nitrógeno líquido. Liofilizar la solución congelada durante la noche para producir sólido peptoid.</li>
		<li>Repetir una vez más la liofilización disolviendo el sólido peptoid en 10 mL de grado HPLC H2O, shell de congelación en nitrógeno líquido y 1.llenar durante la noche. El peptoid resultante es lo suficientemente puro para análisis de la secuencia por espectrometría de masas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS medidas y análisis de la secuencia
Nota: El experimento de MS/MS se realiza en un espectrómetro de masas triple cuadrupolo acoplado a una fuente de electrospray (ESI) de ionización. Recolección de datos se controla mediante el software de adquisición de datos junto con el instrumento. El procedimiento general incluye 1) realizar el experimento de espectrometría de masas de análisis completo y registrar el espectro de masas, 2) realizar el CID MS/MS experimentar y registrar el espectro MS/MS y 3) que compararon los datos espectrales MS/MS con teóricos esquema de fragmentación predicho basado en la característica estructural de la peptoid.
<ol><li>Preparación de la solución de la muestra
	<ol>
<li>Pesar 1.0-2.0 mg sólido peptoid en un frasco de vidrio de 3 a 5 mL. Añadir 1 mL de mezcla solvente de acetonitrilo y agua (ACN/H2O, 1:1, v/v) para disolver el peptoid. Esto da la solución de muestra común con una concentración de 10-3 M.</li>
		<li>Transferir 20 μl de la solución madre a un tubo de centrífuga de 1.5 mL y añadir 1 mL de mezcla solvente de ACN/H2O para dar una solución muestra diluida de cerca de 10-5 M.</li>
		<li>Eliminar las posibles partículas insolubles en la solución muestra diluida por la realización de centrifugación a 4.427 x g por 3 minutos transferir unos 700 μl de la parte superior de la solución a otra centrífuga de 1,5 mL del tubo para hacer el peptoid MS solución de trabajo con concentración de 10-5 M.</li>
		<li>Ajustar la concentración de la solución de trabajo de MS basada en la intensidad de la señal observada durante las mediciones de espectrometría de masas.</li>
		<li>Una manera alternativa para eliminar las posibles partículas insolubles en la solución muestra diluida es la solución de la muestra a través de un filtro de jeringa 0.20 μm y recoger el filtrado en un tubo de centrífuga de 1.5 mL para hacer la peptoid MS solución de trabajo de alrededor de 10-5 M.</li>
	</ol></li>
	<li>Grabación de espectros de masas
	<ol>
<li>Recorren solvente mezclado de ACN/H2O (1:1, v/v) de la fuente (ESI) de la ionización de electrospray y configurar el instrumento en un ion positivo estándar, modo de barrido completo de espectrometría de masas con una gama de la relación masa / carga (m/z) de 100-1500. Nota: Parámetros de funcionamiento típicos: Tensión de la aguja ESI, 5 kV Tensión capilar, 40 V Secado temperatura del gas (nitrógeno), 200 ° C.</li>
		<li>Agregar aproximadamente 300 μL de solución de trabajo de peptoid MS (10-5 M) en una jeringa de 1 mL o 500 μl y conectar la jeringa a la entrada ESI usando tubos de capilares de poliéter éter cetona (PEEK). Coloque la jeringa en la bomba de la jeringuilla y el caudal en 10 μl/min para infundir la solución de muestra en la entrada ESI.</li>
		<li>Encienda la tensión de la aguja ESI para activar el proceso ESI y luego encienda el detector. Configurar la pantalla en modo de perfil y la gama de m/z de 100-1.500. Ver un perfil de espectro de masas mostrado en la ventana de perfil. El pico en m/z 1.265 (aparece como m/z de 1,264.6) corresponde a la peptoid de peptoid ion o protonada.</li>
		<li>Registrar el espectro de MS por 2 min. En la "ventana de método", utilizar 2 min como el "tiempo de ejecución". Abrir la ventana de grabación rellenar un nombre de archivo adecuado y empezar a grabar el espectro. Nota: El espectro de masas resultante se muestra en la figura 3.</li>
		<li>Optimizar la intensidad del pico en m/z de 1.265. La gama de m/z a 1.150-1.350 y ajuste la tensión capilar mientras se visualiza la intensidad de pico en mV que se muestra en la ventana de perfil. Por ejemplo, aumentar la tensión capilar a 50 V o más y ver el cambio de la intensidad de pico. La intensidad de pico óptima es alrededor de 150-200 mV. Nota: Ajuste la tensión capilar puede cambiar significativamente la abundancia de ciertos iones. Aumento de la tensión capilar puede aumentar la intensidad del ion del peptoid. Sin embargo, un alto voltaje capilar también puede inducir la disociación del ion peptoid en la fuente de iones y disminuir la intensidad observada. Ajustar la temperatura del gas de secado puede aumentar la intensidad del pico en m/z 1.265, pero es menos efectivo que el ajuste de la tensión capilar. Si el pico a m/z 1.265 no alcanza la intensidad óptima, ajuste la concentración de muestra (o ejemplo, doble la concentración de la solución de trabajo de MS).</li>
		<li>Cambiar el instrumento en el modo MS/MS. El ion precursor en m/z 1.265 y MS/MS total rango en m/z de 100-1.400. En la "ventana de método", utilizar m/z 1.265 como la "Misa primera Q1" y deje en blanco el "Q1 última misa". Uso de m/z 100 como la "Primera Misa de la Q3" y m/z 1.400 como la Misa "Q3 pasado." Nota: En el modo MS/MS, el primer cuadrupolo (Q1) funciones como filtro masa para aislar el peptoid ion como el ion del precursor, la segunda unidad de cuadrupolo (Q2) es una celda de colisión y el tercer cuadrupolo (Q3) funciones como un analizador de masas.</li>
		<li>Sistema de presión de la energía de colisión en 40 eV y el gas de colisión (argón, en este caso) en 1.5 mTorr.</li>
		<li>Ver un perfil de espectro de masas muestra en la ventana de perfil. El pico en m/z de 1.265 corresponde al ion peptoid, y los picos con valores más bajos de m/z representan los fragmentos del peptoid ion.</li>
		<li>Ajustar la energía de la colisión para optimizar la visualización del espectro de fragmentación. Por ejemplo, aumentar la energía de la colisión a 45 eV y ver el cambio del perfil del espectro. Nota: en general, aumentando la energía de colisión realzará la abundancia de los iones del fragmento y reducir la abundancia del ion del peptoid. Aumento de la presión de gas de colisión también mejorará la abundancia de los iones del fragmento. PRECAUCIÓN: No aumentar la presión del gas de colisión más allá de 2 mTorr.</li>
		<li>Registrar el espectro MS/MS por 2 min. En la "ventana de método", utilizar 2 min como el "tiempo de ejecución". Abrir la ventana de grabación rellenar un nombre de archivo adecuado y empezar a grabar el espectro.</li>
		<li>Repetir 1 - 2 veces la grabación.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de la secuencia de Peptoid Nota: Bajo la condición de CID, el ion peptoid fragmentaría en los enlaces de la amida a lo largo de la columna vertebral de peptoid para producir una serie de fragmentos N-terminal llamado B-iones y una serie de fragmentos c-terminal llamadas iones Y<ol>
<li>Dibujar la estructura química de la peptoid acetilado colocando el N-terminal en el lado izquierdo y el c-terminal a la derecha y dibuja una línea discontinua en cada enlace amida para generar un esquema de fragmentación como se muestra en la Figura 2a. Dibujar un protón con un círculo de puntos para indicar que el portador de la carga. A partir del lado izquierdo de la estructura, colocar etiquetas en las líneas punteadas para indicar los fragmentos N-terminal como B1, B2, B8. A partir de la derecha, coloque las etiquetas en las líneas discontinuas para indicar los fragmentos c-terminal Y1, Y2, Y8. Nota: Un software de dibujo químico puede ser utilizado para dibujar la estructura de peptoid.</li>
		<li>Imaginar la fragmentación en el enlace de amidath 4 del lado izquierdo y dibujar las estructuras del fragmento N-terminal y el fragmento c-terminal con cargos formales adecuados, como se muestra en la figura 2b. Coloque la etiqueta de B4 en el fragmento N-terminal y coloque la etiqueta de Y5 en el fragmento del c-terminal. Calcular el valor de m/z de B4 sumando las masas nominales de los elementos de la estructura para producir un valor de 580 y coloque m/z 580 en el fragmento N-terminal. Calcular el valor de m/z de Y5 y m/z 685 en el fragmento del c-terminal.</li>
		<li>Calcular los valores de m/z para los ocho iones de B y todos los de ocho Y en iones y montarlos en una tabla, como se muestra en la tabla 1. Nota: Los valores de m/z de los fragmentos pueden calcularse usando un producto químico, software de dibujo.</li>
		<li>Abrir el espectro MS/MS grabado de la peptoid usando el software de revisión de datos acompañado con el instrumento. Establecer las preferencias de etiquetado a "Mostrar etiquetas de iones" y sello umbral al 3%. Esto genera un espectro MS/MS con los valores de m/z en los picos.</li>
		<li>La MS/MS datos espectrales como archivo de texto en el formato CSV reconstrucción el espectro utilizando software de procesamiento de datos y el formato de exportación. Colocar valores de m/z en las cumbres. El espectro MS/MS resultante se muestra en la figura 4. Nota: Algunos espectrómetros de masas están equipados con software de procesamiento de datos capaz para generar el espectro MS/MS. En este caso, exportar los datos espectrales MS/MS no es necesario.</li>
		<li>Asignar los valores de m/z aparece en el espectro MS/MS a las que se muestran en el cuadro 1 para identificar el correspondiente B - y Y-iones. Por ejemplo, el pico en el 580 de m/z se identifica como B4-ion y m/z 685 es identificado como el Y5-ion. Etiqueta los picos con los símbolos B y Y correspondientes en el espectro, como se muestra en la figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Multistep+Synthesis+of+a+Bioactive+Peptidomimetic+Oligomer+for+the+Undergraduate+Laboratory.">Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory.</a> J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).</li><li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets.">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).</li><li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type/Arginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity.">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+studies+of+protonated+and+alkali+metalated+peptoids:+Enhanced+sequence+coverage+by+metal+cation+addition.">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li><li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids.">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li><li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation.">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, ha sido sintetizado mediante el protocolo presentado. El aparato de síntesis consiste en un recipiente de polipropileno jeringuilla-como en la reacción de fase sólida y un agitador mecánico. Los reactores están comercialmente disponibles y de bajo costo. Un agitador mecánico es un aparato común en laboratorios de química. Con el uso de un recipiente de reacción similar a la jeringa, soluciones pueden ser arrastradas y empujadas fuera de la nave mov...

Peptoides son una clase de secuencia controlada de polímeros con estructuras de la columna vertebral imitando la estructura de los péptidos. Peptoides pueden ser sintetizados de aminas diversas, que permite peptoides exhibir propiedades altamente ajustables1,2. Peptoides se han utilizado como modelos moleculares para la investigación biofísica, considerados como agentes terapéuticos y diseñado como ligandos para proteínas3,4,5,6. Peptoides se han desarrollado en una variedad de compuestos biológicamente activos, como los materiales anti-fouling y anticuerpo miméticos, agentes antimicrobianos y enzima inhibidores7,8,9. Con una naturaleza altamente ordenada y armoniosa, peptoides han también sido considerados como un tipo de almacenamiento de información molecular10. El descubrimiento de estas llamadas de diversas aplicaciones para el desarrollo de eficientes métodos analíticos para caracterizar la secuencia y estructura de peptoides. Técnicas basadas en espectrometría de masa Tandem han demostrado promesa como el método de elección para el análisis de las propiedades de la secuencia de polímeros de secuencia controlada, incluyendo peptoides11,12,13, 14,15. Sin embargo, estudios sistemáticos de la correlación de los patrones de fragmentación de iones peptoid resultantes de estudios de espectrometría de masas y la información estructural de peptoides son muy limitadas.
Peptoides pueden sintetizarse fácilmente utilizando un método de fase sólida. El método desarrollado consiste en una iteración de un proceso de dos pasos monómero además ciclo16,17. En cada ciclo además, una amina resina es acetilada por un ácido Haloacético (típicamente Ácido bromoacético, BMA), y esto es seguido por una reacción de desplazamiento con una amina primaria. Aunque han aplicado rutinariamente protocolos de síntesis automatizada para peptoid síntesis, peptoides pueden sintetizarse manualmente con excelentes rendimientos en una química estándar laboratorio16,18,19, 20.
Nuestro laboratorio ha adoptado el método de síntesis de peptoid manual y simplificado del aparato utilizado en los métodos existentes. Anteriormente hemos estudiado los patrones de fragmentación de una serie de peptoides usando MS/MS técnicas21,22,23. Nuestros resultados muestran que peptoides producen fragmentaciones característica cuando se someten a disociación colisión-inducida (CID)21,23 o22 experimentos de disociación (ECD) de captura de electrón. En este artículo se demuestra cómo oligo-peptoides pueden sintetizarse en un laboratorio de química estándar, cómo realizar los experimentos de CID utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo y cómo analizar los datos espectrales. El peptoid a ser sintetizado y caracterizado es un nonamer con acetilación N-terminal y c-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. La estructura de la peptoid se muestra en la figura 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software</td>
			<td>Varian Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The software is a part of the Varian 320L package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td>
			<td>Fisher Scientific International Inc.</td>
			<td>14-400-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hermle Centrifuge, Model Z 206 A</td>
			<td>Hermle Labortechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase reaction vessel, 10 mL</td>
			<td>Torviq</td>
			<td>SF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure caps for reaction vessels</td>
			<td>Torviq</td>
			<td>PC-SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, pore size 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>03-391-3B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, pore size 0.45 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>03-391-3A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>490001-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>490001-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td>
			<td>CambridgeSoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam cup, 12 Oz</td>
			<td>Common Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink amide resin</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>10619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>02351</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00110</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>26843</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phenylethylamine</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>EM8.07334.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyoxyethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>241067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Boc-ethylenediamine</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>AAAL19947-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>252845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-dimethylformamide</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>BDH1117-4LG</td>
			<td>Further distillation before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-diisopropylethylamine</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>01966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00289</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>ZMQP60001</td>
			<td>For generating HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced from Millipore MILLI-Q&#174; Academic Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>339USP/NF</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific International, Inc.</td>
			<td>A998-4</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>BDH1121-19L</td>
			<td>Further distillation before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>BDH1113-19L</td>
			<td>Further distillation before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td>
			<td>NIT 50-C-F</td>
			<td>Ultra high purity, 99.9995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td>
			<td>ARG 50-C-F</td>
			<td>Ultra high purity, 99.9995%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids

Peptoides son oligómeros de péptido imitando secuencia controlado que consta de unidades de N-alquilados glicina. Entre muchas aplicaciones potenciales, peptoides han pensado de como un tipo de almacenamiento de información molecular. Análisis de espectrometría de masas se ha considerado el método de elección para la secuencia peptoides. Peptoides pueden ser sintetizados vía química de fase sólida usando un ciclo de reacción de dos pasos repetidos. Aquí presentamos un método para sintetizar manualmente oligo-peptoides y analizar la secuencia de peptoides mediante técnicas de espectrometría de masas (MS/MS) de tándem. La peptoid de la muestra es un nonamer consisten en alternar N-(2-methyloxyethyl) glicina (Nme) y N-(2-FENILETILO) glicina (Npe), así como una N-(2-aminoetil) glicina (Nae) a N-terminal. La fórmula de la secuencia de la peptoid es Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, donde Ac es el grupo acetilo. La síntesis tiene lugar en un recipiente de la reacción de fase sólida disponible en el mercado. La resina amida de pista se utiliza como soporte sólido para la peptoid con un grupo amida en el c-término. El producto resultante de la peptoid se somete a análisis de la secuencia usando un espectrómetro de masas triple cuadrupolo acoplado a una fuente de ionización por electrospray. La medida MS/MS produce un espectro de iones fragmento resultante de la disociación de peptoid cargado. Los iones fragmento se clasifican hacia fuera basado en los valores de su relación masa / carga (m/z). Los valores de m/z de los iones del fragmento se comparan con las masas nominales de iones fragmento teóricamente predicho, según el esquema de fragmentación de peptoid. El análisis genera un patrón de fragmentación de la peptoid cargada. El patrón de fragmentación está correlacionado con la secuencia de monómeros de peptoid neutro. En este sentido, el análisis por MS lee la información de la secuencia de la peptoides.

La estructura de un peptoid 9-mer con la acetilación N-terminal, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, se muestra en la figura 1. El peptoid fue sintetizado manualmente en un recipiente de la reacción de polipropileno sinterizado vía fase sólida. Pista amida resina (0,047 mmol, mg 84 con una carga de 0,56 mmol/g) es utilizado como soporte sólido para el peptoid con un amidated c-término. La cadena peptoid está construida por varios ciclos de la ...

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Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo

Un protocolo se describe para la manual síntesis de oligo-peptoides seguido por análisis de la secuencia por espectrometría de masas.

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K vistas.  University of the Pacific. Un protocolo se describe para la manual síntesis de oligo-peptoides seguido por análisis de la secuencia por espectrometría de masas.

Video: Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Investigación

Química

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The analysis of volatile and oxidation sensitive compounds by mass spectrometry is not easily achieved, as all state-of-the-art mass spectrometric methods require at least one sample preparation step, e.g., dissolution and dilution of the analyte (electrospray ionization), co-crystallization of the analyte with a matrix compound (matrix-assisted laser desorption/ionization), or transfer of the prepared samples into the ionization source of the mass spectrometer, to be conducted under atmospheric conditions. Here, the use of a sample inlet system is described which enables the analysis of volatile metal organyls, silanes, and phosphanes using a sector field mass spectrometer equipped with an electron impact ionization source. All sample preparation steps and the sample introduction into the ion source of the mass spectrometer take place either under air-free conditions or under vacuum, enabling the analysis of compounds highly susceptible to oxidation. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes, which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique. The principle of operation is presented in this video.

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique.

Análisis de compuestos volátiles y sensibles oxidación usando un sistema de entrada de frío y de Impacto electrónico Espectrometría de Masas

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

La visualización del ambiente Espectrometría de Masas con el uso de la fotografía Schlieren

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Rápida de alto rendimiento Identificación de Especies de material botánico Uso del análisis directo en tiempo real de alta resolución Espectrometría de Masas

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Análisis de la respiración en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria Nanoelectrospray acoplada a espectrometría de masas de alta resolución

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. The single-probe, a microscale sampling and ionization device, can be coupled with a mass spectrometer for on-line, rapid SCMS analysis of cellular constituents under ambient conditions. Previously, the single-probe SCMS technique was primarily used to measure cells immobilized onto a substrate, limiting the types of cells for studies. In the current study, the single-probe SCMS technology has been integrated with a cell manipulation system, typically used for in vitro fertilization. This integrated cell manipulation and analysis platform uses a cell-selection probe to capture identified individual floating cells and transfer the cells to the single-probe tip for microscale lysis, followed by immediate mass spectrometry analysis. This capture and transfer process removes the cells from the surrounding solution prior to analysis, minimizing the introduction of matrix molecules in the mass spectrometry analysis. This integrated setup is capable of SCMS analysis of targeted patient-isolated cells present in body fluids samples (e.g., urine, blood, saliva, etc.), allowing for potential applications of SCMS analysis to human medicine and disease biology.

An integrated cell manipulation platform is developed for use in conjunction with a single-probe mass spectrometry setup for the on-line analysis of individual suspension cells under ambient conditions.

Plataforma de manipulación celular integrada junto con la sonda única para el análisis de espectrometría de masas de fármacos y metabolitos en células de suspensión única

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

Análisis de moléculas complejas y sus reacciones en superficies por medios de espectrometría de masas de desorción/ionización inducida por racimos

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Intercambio de hidrógeno/deuterio basado en electroforesis capilar para la caracterización conformacional de proteínas con espectrometría de masas de arriba hacia abajo

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caracterización de modificaciones de ARN en neuronas individuales mediante espectrometría de masas

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...