El estudio de cómo los microbios regulan la composición química de las bicapas individuales informará nuestro conocimiento de los mecanismos de matanza de antibióticos, resistencia a los antimicrobianos y patogénesis de enfermedades. Esta técnica divide la envolvente celular de bacterias gramnegativas en dos fracciones definidas sin usar detergente. Por lo tanto, los lípidos, proteínas y azúcares se pueden evaluar en un ambiente semi-nativo.
Algunos de los pasos dependen del tiempo y requieren enfoque y coordinación. Inicialmente, utilice una o dos muestras. Cuando el nivel de confort aumenta, se pueden agregar más muestras.
No se deben manipular más de seis muestras a la vez. Este es un procedimiento de varios días y los puntos de control visuales son útiles para evaluar la eficacia y el error. Antes de realizar estos pasos a veces finales.
Rayar las bacterias de las existencias de glicerol congelados en placas de agar frescas. Una vez que las colonias se desarrollen, almacene las placas en cuatro grados centígrados. Utilice una sola colonia para inocular un tubo de cinco mililitros lleno de medios de caldo y cultivar las bacterias como se desee durante la noche.
La espalda diluye el cultivo bacteriano durante la noche en un litro de los medios de caldo preferidos e incuba los matraces. Una vez alcanzada la densidad óptica deseada, retire los matraces de la incubadora y colóquelos sobre hielo. Mida la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros y calcule el volumen de cultivo que equivale a entre seis y ocho veces 10 a las unidades formadoras de colonias bacterianas undécimas.
Agregue este volumen de cultivo a un tubo centrífugo y asegúrese de que los cultivos restantes permanezcan en hielo hasta que se utilicen. Pelecila las bacterias por centrifugación durante 10 minutos en un ángulo fijo, centrífuga de alta velocidad a 7.000 a 10.000 veces G y cuatro grados Celsius. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y desecharlo.
Resuspender cada pellet celular en 12,5 mililitros de tampón A.Añadir una barra de agitación magnética a la suspensión celular. Añadir 180 microlitros de 10 miligramos por mililitro de lysozyme a cada resuspensión celular. Después de recoger las bacterias tratadas con lisozima EDTA por centrifugación, añadir rápidamente el inhibidor de la proteasa, cloruro de magnesio y nucleasa a las bacterias y resuspend rápidamente las células en el tampón B.Stir durante dos minutos, manteniendo las suspensiones sobre hielo.
A continuación, agregue 12,5 mililitros de 1,5 mililitros de solución EDTA a cada célula re-suspensión y continúe revolviendo sobre hielo durante siete minutos adicionales. Decantar las suspensiones en tubos cónicos de 15 mililitros. Centrifugar las suspensiones a 9.000 a 11.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche los sobrenadantes en un contenedor de residuos de riesgo biológico y conserve los pellets sobre hielo. Añadir 25 mililitros de tampón B a cada pellet de célula. A continuación, agregue 55 microlitros de un cloruro de magnesio molar, un microlitro de reactivo de arnés/adn/nucleasa y un microlitro de cóctel inhibidor de la proteasa.
Resuspender los pellets en la mezcla. Pipeta y vórtice vigorosamente hasta que las soluciones parezcan homogéneas. Almacene las suspensiones en hielo.
Vierta la muestra en el cilindro de muestra homogeneizador y lleve la célula a 20.000 PSI. Para evitar la aerosolización de patógenos, acondicione el aparato presurizado en el tampón B y ajuste los niveles de presión antes de añadir la suspensión bacteriana. Encienda la célula de presión y alude 10 mililitros del tampón B como precaución.
Recoger el analitis celular en tubos cónicos de 50 mililitros sobre hielo mientras también mantiene las muestras en hielo. Para lograr una lelisis completa, repita este proceso de tres a cinco veces. Para peletizar el material celular restante, intacto, centrifugar las muestras bacterianas de lesed a 6, 169 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.
Distribuir los sobrenadantes que ahora contienen las membranas homogeneizadas, en botellas de policarbonato para la ultracentrifugación. Ultracentrífuir la célula se lysates a 184, 500 veces G y cuatro grados Celsius durante al menos una hora. Deseche los sobrenadantes y conserve los pellets de membrana sobre hielo.
Usando un vidrio, homogeneizador Dounce, resuspender los pellets de membrana en un mililitro de la solución de gradiente de sacarosa isopicónica de baja densidad. A continuación, utilice un vaso, pipeta Pasteur para transferir el homogeneización de la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y coloque el tubo sobre hielo. Para preparar el gradiente de sacarosa, sostenga un tubo Open-Top de polipropileno o Ultra-claro en una posición ligeramente inclinada.
Añadir lentamente dos mililitros de la solución de sacarosa de mayor densidad. A continuación, agregue cuatro mililitros de la solución de sacarosa de menor densidad. Al preparar el gradiente de densidad, agregue la solución de sacarosa lentamente para evitar mezclar las capas.
Las capas de sacarosa deben ser ligeramente visibles y aparecer generalmente definidas. A continuación, agregue la fracción de membrana total que previamente se resuspendió en un mililitro de baja densidad, solución de sacarosa isopicnic. Por último, llene el resto del tubo añadiendo aproximadamente seis mililitros de la solución de gradiente de sacarosa isopicónica de baja densidad.
Ultracentrífafuse las muestras usando un rotor de cubo oscilante a 288.000 veces G y cuatro grados Celsius durante 16 a 23 horas. Corte el extremo de una punta de pipeta P1000 a unos cinco mililitros desde el punto. Una vez completada la centrifugación, utilice la pipeta para extraer la capa superior de color marrón del tubo.
Transfiera esta capa, que contiene la fracción de membrana interna, a una botella de policarbonato para ultracentrifugación. Deje unos dos mililitros de la solución de sacarosa por encima de la interfaz entre la sacarosa 53% y la sacarosa 73%para asegurarse de que la fracción de membrana externa inferior, blanca y externa no se cruza contaminan la fracción de membrana interna. Una vez más usando una punta de pipeta P1000 con el extremo quitado, retire la capa de membrana externa y transfiétela a una botella de policarbonato.
Llene el vacío restante de la botella de policarbonato con tampón de almacenamiento de membrana aislado y mezcle por inversión o tubería. Conservar las muestras sobre hielo. Para recoger las membranas, ultracentrifugar las botellas de policarbonato a 184, 500 veces G y cuatro grados Celsius durante una hora.
Por último, deseche los sobrenadantes y agregue de 500 a 1.000 microlitros de búfer de almacenamiento. Resuspender las membranas por homogeneización Dounce. Recoja las muestras en tubos de microcentrífuga de dos mililitros.
Los pellets de membrana total fueron raspados, homogeneizados por Dounce y ultracentrifugados sobre gradientes de densidad de sacarosa para separar las membranas internas y externas. Un gradiente de densidad de sacarosa del 20%53%73% fue suficiente para dividir algunas cepas bacterianas. Pero no para particionar A.baumannii que fue particionado con éxito usando un 20%45%73%gradiente.
Para evaluar la eficiencia de la separación, se analizaron muestras de membrana para la NADH deshidrogenasa, una enzima ubicada en la membrana interna bacteriana. Una disminución de la densidad óptica a 340 nanómetros indicaba la presencia de la enzima. La densidad óptica se midió para muestras de 50 microgramos de fracciones de membrana internas y externas de tipo salvaje S.typhimurium, E.coli K12 DH5a y galE mutante S.typhimurium.
Se añadió una mayor concentración de proteína al ensayar la pureza de las fracciones de membrana de A.baumannii porque un ensayo inicial con 50 microgramos sugirió que los niveles relativos de NADH deshidrogenasa eran menores para A.baumannii que para las otras cepas bacterianas. Para evaluar la contaminación cruzada de las fracciones de membrana interna con fracciones de membrana externas, se extrajeron y visualizaron LPS y LOS. Los extractos fueron cargados en un gel de poliacrilamida y teñidos con Pro-Q Emerald 300.
Acinetobacter baumannii es una prioridad, multi resistente a los medicamentos, patógeno humano. Este protocolo debe ayudar a los investigadores en la comprensión de las funciones de lipooligosacáridos, fosfolípidos y lipoproteínas en los mecanismos de resistencia y virulencia de este patógeno único e importante. Este método es ideal para el análisis posterior de fosfolípidos, carbohidratos glucólidos, proteínas y moléculas pequeñas que normalmente existen dentro de las membranas duales de bacterias gramnegativas.
