Este protocolo agiliza la identificación de glicóp%eptidas bacterianas, lo que permite a los investigadores identificar nuevos eventos de glicosilación, así como las diferencias en los glicanos utilizados para la glicosilación entre cepas. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los expertos en no glicosilación identificar posibles eventos de glicosilación en muestras de proteoma bacteriano. La búsqueda abierta es un enfoque generalmente aplicable que se puede utilizar para la identificación de una gama de modificaciones, no solo la glicosilación, y se puede aplicar a cualquier muestra de proteoma.
Para preparar los consejos de extracción STB-RPS stop-and-go, use una aguja roma de calibre 14 para extraer tres discos STB-RPS de una membrana STB-RPS de 47 milímetros cuadrados para unir 50 microgramos de péptido. Para cantidades de péptidos más grandes, aumente el número de discos en consecuencia. Antes de usar las puntas de la etapa SDB-RPS, lave las puntas agregando 150 microlitros de 100% acetonitrilo e girando el tampón por centrifugación o aplicando presión suavemente con una jeringa.
A continuación, lave las puntas con 150 microlitros de 30% de metanol que contengan 1% de TFA, luego equilibre las puntas con 150 microlitros de 90% de isopropanol que contengan 1% de TFA. Después del equilibrio, cargue las muestras de proteoma en las puntas de la etapa STB-RPS por centrifugación o con una jeringa. Luego, lave las puntas con 150 microlitros de 90% de isopropanol que contengan 1% de TFA seguido de 150 microlitros de 1% de TFA.
Para eluir los péptidos de las puntas de la etapa STB-RPS, use 150 microlitros de hidróxido de amonio al 5% y 80% de acetonitrilo agregado a una sola punta y recoja las muestras eluidas en tubos individuales aplicando presión suavemente con una jeringa. Alternativamente, si se libera a través de centrifugación, use 150 microlitros al 5% de hidróxido de amonio en 80% de acetonitrilo agregado a todas las puntas de la etapa y recójalo en una placa limpia. Secar los péptidos eluidos por centrifugación al vacío a 25 grados centígrados.
A continuación, para enriquecer las muestras de glicopéptidos, prepare una cromatografía líquida de interacción hidrofílica zwitteriónica, o ZIC-HILIC, puntas de etapa. Extraiga un disco C8 de una membrana C8 de 470 milímetros cuadrados con una aguja roma de calibre 14 y empaque el disco en una punta P-200 para crear una frita. Luego, agregue aproximadamente cinco milímetros de material ZIC-HILIC resuspendido en acetonitrilo al 50% sobre la fritura aplicando presión suavemente con una jeringa.
Antes de usar las puntas, equilibre la resina con 20 volúmenes de lecho de tampón de elución ZIC-HILIC, dejando 10 microlitros de volumen por encima de la resina para asegurarse de que la resina no se seque. Luego, lave secuencialmente la resina con 20 volúmenes de lecho de tampón de preparación ZIC-HILIC seguido de 20 volúmenes de lecho de carga ZIC-HILIC o tampón de lavado. A continuación, resuspenda los péptidos digeridos y secos en el tampón de carga ZIC-HILIC a una concentración final de cuatro microgramos por microlitro.
Vórtice brevemente durante un minuto para asegurarse de que las muestras se resuspendan y luego girarlas durante un minuto a 2000 veces G y 25 grados Celsius. Después de girar, cargue la muestra de péptido resuspendido en la columna ZIC-HILIC acondicionada, luego lave la columna tres veces con 20 volúmenes de lecho del tampón de carga ZIC-HILIC aplicando suavemente presión con una jeringa. Finalmente, eluya los glicopéptidos con 20 volúmenes de lecho del tampón de elución ZIC-HILIC en un tubo de 1,5 mililitros aplicando presión suavemente con una jeringa, luego seque el eluyente mediante centrifugación al vacío a 25 grados centígrados.
Para el análisis LC-MS, vuelva a suspender las muestras en Buffer A* a una concentración final de un microgramo por microlitro, luego cargue las muestras en un HPLC-UPLC acoplado a un MS para permitir la separación e identificación de glicopéptidos. Supervise la recopilación de datos de EM resultante, asegurándose de que los datos se recopilan con los parámetros deseados. Para analizar las muestras enriquecidas con proteoma y glicopéptidos, abra FragPipe y haga clic en la pestaña Flujo de trabajo.
En el menú desplegable Flujo de trabajo, seleccione la opción Abrir búsqueda y haga clic en Agregar archivos para importar los archivos de datos que se buscarán en FragPipe. Luego, haga clic en la pestaña Base de datos seguida de Descargar para iniciar el administrador de descargas para descargar bases de datos de proteomas de UniProt utilizando un número de acceso de UniProt. Dentro del administrador de descargas, haga clic en la opción Agregar señuelos y contaminantes para incorporar señuelos y proteínas contaminantes en esta base de datos.
A continuación, haga clic en la pestaña MSFragger y, a continuación, en el cuadro Coincidencia máxima, aumente la tolerancia de masa del precursor de 500 dalton predeterminado a 2.000 dalton para identificar modificaciones grandes. Haga clic en la pestaña Ejecutar para definir la ubicación de las salidas de FragPipe y, a continuación, haga clic en el botón Ejecutar para comenzar la búsqueda. Con glicopéptidos de alta confianza asignados, identifique iones asociados a glicanos comúnmente observados para mejorar la identificación de glicopéptidos.
A continuación, haga clic en la ficha MSFragger y agregue las masas delta determinadas de los glicanos observados en las secciones Modificaciones de variables y Desplazamientos de masa con masas individuales separadas con una barra diagonal. Luego, agregue las masas de fragmentos asociadas a glicanos de estos glicanos en la sección Glyco/Labile Mods de MSFragger. Finalmente, cargue todos los datos de EM asociados con estudios proteómicos en repositorios proteómicos centralizados, como los repositorios PRIDE o MassIVE.
La búsqueda abierta de la cepa AB307-0294 de Acinetobacter baumannii reveló dos masas delta dominantes correspondientes a 648,25 y 692,28 daltons. Se sabe que la cápsula ACICU está compuesta por una unidad K de tetrasacárido correspondiente a una masa prevista de 843.31 dalton. Esta estructura de la cápsula es consistente con la masa delta observada con mayor frecuencia dentro de la ACICU.
El análisis de búsqueda abierta de la cepa D1279779 reveló la presencia de múltiples masas delta consistentes con 203.08, 794.31 y 1588.62 daltons. Utilizando el anotador espectral de péptidos interactivos, se evaluaron los glicopéptidos identificados en tres cepas de A.baumannii que revelan posibles iones asociados a glicanos. Las búsquedas centradas en glicanos condujeron a un aumento notable en el número total de coincidencias espectrales glicopéptido/péptido identificadas en las tres cepas de A.baumannii, lo que corresponde a un aumento del 37% en ACICU, un aumento del 117% en AB307-0294 y un aumento del 363% en D1279779.
Para eventos individuales de EM, la inclusión de información específica de glicanos generalmente aumenta la hyperpuntuación observada, aunque este aumento es altamente dependiente de glicanos. Al realizar el enriquecimiento ZIC-HILIC, asegúrese de que la resina permanezca siempre húmeda, ya que la pérdida de disolvente puede comprometer el aislamiento de los glicopéptidos. Los datos sobre las diferencias en la glicosilación se pueden utilizar para informar los estudios de mutagénesis o identificar clases de genes responsables de la biosíntesis de glicanos.
Utilizando la búsqueda en bases de datos abiertas, hemos comenzado a caracterizar la diversidad de glicanos en todos los géneros bacterianos. Esto ha demostrado que la glicosilación bacteriana es más común y mucho más diversa de lo que pensábamos.
