Este trabajo fue apoyado por becas AI064184 y AI76322 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y por Grant 61789-MA-MUR de la Oficina de Investigación del Ejército de MST investigación también fue apoyada por Welch Beca de la Fundación F1155 y NIH subvención R01GM103655 a JSB

No hay conflictos de interés declarado.

En este protocolo hemos detallado el aislamiento de especies de lípido A partir de células enteras de bacterias, y descrito TLC o métodos analíticos basados ​​en MS para caracterizar químicamente el material aislado. Tandem espectrometría de masas es una estrategia poderosa para la caracterización estructural de novo de compuestos biológicos, y tiene un valor incalculable para la caracterización química de la panoplia de moléculas de lípido A se observan en la naturaleza. CID y UVPD son dos mét...

El lipopolisacárido (LPS) es la principal molécula de la superficie exterior de casi todos los organismos gram-negativas y consiste en tres dominios moleculares: un polisacárido distal antígeno O-, un oligosacárido de núcleo, y el lípido de membrana-asociada Un dominio depositado sobre la cara externa de la 1,2 bicapa de la membrana externa. El lípido A de dominio se compone de 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (KDO) y un lípido residuos de una especie molecular, en donde el lípido A puede ser definida como la porción soluble en cloroformo de LPS después de la hidrólisis suave de ácido-1, 2. El lípido estándar Una molécula puede definirse químicamente como una columna vertebral diglucosamine que es hexa-acilada y bis-fosforilado; consistente con las principales especies de lípido A observadas en el organismo modelo Escherichia coli (E. coli) 1,2. Nueve genes expresados ​​constitutivamente, conservados a lo largo de las bacterias gram-negativas, son responsables de la producción del lípido A de dominio (Figura 1) 1,2. La mayoría de las bacterias tienen un conjunto adicional de los genes, que varían en el grado de conservación filogenética, que participan en la modificación química adicional del lípido A 3. Desfosforilación, eliminación de cadenas de acilo, y la adición de restos químicos tales como amino azúcares (por ejemplo aminoarabinosa) y / o fosfoetanolamina son las actividades más comúnmente observados (Figura 1). Muchas de las enzimas responsables de lípidos Una modificación son activados directamente por señales ambientales, como cationes bivalentes, o su expresión está regulada por dos sistemas de respuesta del regulador de los componentes 3. Reconocimiento de especies de lípidos A por el sistema inmune innato de acogida está mediada por el receptor Toll-like factor de diferenciación 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Fuerzas hidrófobas entre MD2 y el lípido A cadenas de acilo, así como entre TLR4 y los &quot;grupos 1 y 4 de fosfato de lípido A promover la fuerte asociación de labioIdentificación A con TLR4/MD2 4,5. Las modificaciones que alteran el estado de acilación o la carga negativa del lípido A de lípidos basada impacto de TLR4/MD2 Un reconocimiento y estimulación aguas abajo de la respuesta inmune innata activadores de NF-kappa B y mediadores de la inflamación tales como TNF y IL-1-β 6,7. Modificaciones que enmascaran la carga negativa del lípido A también impiden péptidos antimicrobianos catiónicos bactericidas de la unión a bacterias Gram-negativas superficies celulares 3,8. Muchas modificaciones lípido A son la hipótesis de aumentar la aptitud bacteriana bajo condiciones ambientales específicas, como en el interior del huésped humano o en un nicho ecológico. Por esta razón muchas enzimas de modificación son objetivos atractivos para el desarrollo racional de compuestos antimicrobianos. La diversidad química de las estructuras de lípido A, con respecto al organismo y / o el medio ambiente, y las implicaciones biológicas de estas diversas estructuras hacer la caracterización estructural de lípido A un esfuerzo importante en Testudie de bacterias gram-negativas. Aislamiento de moléculas de lípidos A de bacterias enteras implica la extracción de LPS de la superficie celular bacteriana, un paso hidrolítica para liberar el lípido A, seguido de un procedimiento de purificación final 9-11. El procedimiento de extracción más frecuentemente citada LPS es el procedimiento de extracción de agua caliente-fenol, primero introducido por Westphal y Jann 10. Después de toda la extracción de LPS se somete a hidrólisis leve de ácido, que separa químicamente Kdo de la 6&#39;-hidroxilo del azúcar glucosamina distal del lípido A (Figura 1). Existen numerosas trampas para el procedimiento de agua caliente-fenol incluyendo el uso de un reactivo de alta peligrosidad, la necesidad de degradar ácidos co-extraídos nucleicos y proteínas, y varios días se requieren para completar el protocolo 10. Nuestro laboratorio ha desarrollado aún más la extracción y aislamiento de lípido A como el desarrollado por primera vez por Caroff y Raetz 12,13. En comparación con los procedimientos de agua caliente-fenol, el método presentado aquí es más rápida y eficiente, y se adapta a una amplia gama de volúmenes de cultivo de 5 ml a múltiples litros. Por otra parte, a diferencia de las extracciones de agua caliente de fenol, nuestro método no selecciona para rugosas o lisas-tipos de LPS, proporcionando una óptima recuperación de las especies de lípidos A. En nuestro protocolo, lisis química de las células bacterianas enteras se lleva a cabo utilizando una mezcla de cloroformo, metanol y agua, donde LPS pueden ser un sedimento por centrifugación. Una combinación de hidrólisis ácida suave y extracciones con disolvente (Bligh-Dyer) se utilizan para liberar lípido A de polisacárido unido covalentemente. El método de Bligh y Dyer se aplicó primero a la extracción de especies de lípidos a partir de una variedad de animales y tejidos vegetales 14, modificado aquí para separar polisacárido hidrolizado de lípido A. En esta etapa de separación final, cloroformo lípidos solubles particionan selectivamente en la parte baja orgánica fase. Para purificar más lípido A, fase inversa ocromatografía de columna de intercambio aniónico se puede utilizar 12. Después del aislamiento de la especie A de lípidos a partir de células enteras, un número de métodos de análisis se puede utilizar para caracterizar la estructura química del material aislado tales como RMN, TLC, y el análisis basado en MS. RMN permite no destructivo elucidación estructural y proporciona detalles estructurales relacionados con enlaces glucosídicos, la asignación inequívoca de posiciones de la cadena de acilo, y la asignación de sitios de unión para los lípidos modificaciones A como aminoarabinosa o fosfoetanolamina 15-17. El análisis de RMN de lípido A no se discute dentro de nuestro protocolo, pero se ha descrito adecuadamente en otras partes 15,16. Para un rápido análisis TLC basan métodos se utilizan con frecuencia, pero no proporcionan información directa sobre la estructura química fina. Protocolos basados ​​MS son el método más frecuentemente utilizado para caracterizar las estructuras lipídicas A 18,19. Matriz asociada desorción láser de ionización (MALDI)-MS se utiliza a menudo para estudiar inicialmente las especies intactas lípido. Iones de una sola carga se generan a partir del analito preparado de acuerdo con nuestros procedimientos de extracción. Como se requiere un análisis estructural más bien, los métodos basados ​​en MS / MS prueban más informativo que MALDI-MS. Junto a ionización por electrospray (ESI) de lípidos simple o múltiple cobrará un iones precursores son aún más fragmentado por disociación inducida por colisión (CID) o fotodisociación ultravioleta (UVPD), para generar iones producto estructuralmente informativos 18,20,21. Productos para bajar de Neutrales de lípido A iones precursores también se generan con frecuencia durante ESI-MS proporciona una capa adicional de información estructural. Espectrometría de masas en tándem (MS / MS) ha demostrado ser un método indispensable y versátil para la elucidación de las estructuras de lípido A. Durante MS / MS, los iones se activan para producir un patrón de fragmentación de diagnóstico que se puede utilizar para elucidar la estructura del ión precursor. El que más se available método MS / MS es CID. Este método produce fragmentos de iones a través de colisiones de la ión precursor seleccionado con un gas inerte de destino, lo que resulta en la deposición de energía que conduce a la disociación. CID ha demostrado ser una herramienta importante en la asignación de la estructura del lípido A para una amplia gama de especies bacterianas 22-33. Aunque CID es el método más universalmente aplicado MS / MS, se genera un conjunto limitado de iones de productos. 193 nm UVPD es una alternativa y un método de MS / MS complementaria. Este método utiliza un láser para irradiar iones, y la absorción de fotones resulta en la activación de los iones y posterior disociación. Esta energía superior técnica de MS / MS produce una gama más diversa de iones producto que CID y por lo tanto proporciona patrones de fragmentación más informativos. En particular, UVPD proporciona información sobre los cambios sutiles en las especies de lípidos A con base en divisiones en glicosídico, amina, acilo y CC bonos ligados 18,21,34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

El lipopolisacárido (LPS) es la principal molécula de la superficie celular de las bacterias gram-negativas, depositado sobre la cara externa de la bicapa de la membrana externa. LPS se pueden subdividir en tres dominios: el O-polisacárido distal, un oligosacárido de núcleo, y el lípido A de dominio que consiste en un lípido una especie molecular y residuos de ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (KDO). El dominio lípido A es el único componente esencial para la supervivencia celular bacteriana. Después de su síntesis, el lípido A se modifica químicamente en respuesta a las tensiones ambientales tales como el pH o la temperatura, para promover la resistencia a compuestos antibióticos, y para evitar el reconocimiento por los mediadores de la respuesta inmune innata de acogida. El siguiente protocolo se detalla el aislamiento escala pequeña y gran del lípido A de bacterias gram-negativas. Material aislado después se caracteriza químicamente por cromatografía en capa fina (TLC) o la espectrometría de masa (MS). Además de láser asistida por matriz de desorción / ionización de tiempo de fluz (MALDI-TOF) de MS, también describe los protocolos MS en tándem para el análisis de los lípidos una especie molecular usando ionización por electrospray (ESI) acoplado a disociación inducida por colisión (CID) y recién empleados fotodisociación ultravioleta métodos (UVPD). Nuestros protocolos MS permiten la determinación inequívoca de la estructura química, de suma importancia para la caracterización de moléculas de lípido A que contienen las modificaciones químicas únicas o nuevas. También describimos el marcaje con radionúclidos, y el posterior aislamiento, del lípido A de las células bacterianas para el análisis por TLC. Relativa a los protocolos basados ​​en MS, la TLC proporciona un método de caracterización más económica y rápida, pero no se puede utilizar para asignar de forma inequívoca lípido A las estructuras químicas sin el uso de normas de estructura química conocida. En las últimas dos décadas el aislamiento y caracterización de lípido A ha dado lugar a numerosos descubrimientos interesantes que han mejorado nuestra comprensión de la fisiología de las bacterias gram-negativas, los mecanismos de resistencia a los antibióticoscia, la respuesta inmune innata humana, y han proporcionado a muchos nuevos objetivos en el desarrollo de compuestos antibacterianos.

Lípido A de E. canónica coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium es un disacárido hexa-acilada de glucosamina con grupos fosfato en las posiciones 1 - y 4 &#39;posiciones. Durante el crecimiento en medios ricos (por ejemplo, caldo de Luria) una porción del lípido A contiene un grupo pirofosfato en la posición 1 produciendo una especie-tris fosforilada 36 (Figura 1). Kdo (-D-manno-octulosonic 3-desoxi ácido), está unido en la ...

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Aislamiento y caracterización del dominio lípido A del lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram-negativas proporciona información sobre los mecanismos de la superficie celular a base de resistencia a los antibióticos, la supervivencia bacteriana y la forma física, y cómo químicamente diversa lípido A las especies moleculares modulan diferencialmente acogida la respuesta inmune innata.

Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

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31.5K vistas.  The University of Texas at Austin.  Aislamiento y caracterización del dominio lípido A del lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram-negativas proporciona información sobre los mecanismos de la superficie celular a base de resistencia a los antibióticos, la supervivencia bacteriana y la forma física, y cómo químicamente diversa lípido A las especies moleculares modulan diferencialmente acogida la respuesta inmune innata. 

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Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

Radicales Libres en Biología Química: del comportamiento químico al desarrollo de biomarcadores

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Investigación

Química

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Plegable y caracterización de un Robot Bio-sensible de ADN Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucleósidos Trifosfatos - De la síntesis a la Caracterización bioquímica

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

Un enfoque de análisis inverso a la caracterización de Transporte de Productos Químicos en Pinturas

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Marcos de síntesis y caracterización de funcionalizado metal-orgánico

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Preparación de células adherentes, por Imágenes de fluorescencia de rayos X por Química Fijación

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Síntesis y caracterización de supramoleculares Coloides

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

Seco de microfluidos-spinning y caracterización de las fibras regeneradas fibroína de seda

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of this compound commences from [Ru(NH3)5Cl]Cl2 in 1 M NH4OH in a closed container, yielding a green solution. Purification is accomplished with cation-exchange chromatography. This compound is characterized and verified to be pure by UV-vis and IR spectroscopy. The mitochondrial calcium uptake inhibitory properties are assessed in permeabilized HeLa cells by fluorescence spectroscopy.

A protocol for the synthesis, purification, and characterization of a ruthenium-based inhibitor of mitochondrial calcium uptake is presented. A procedure to evaluate its efficacy in permeabilized mammalian cells is demonstrated.

Síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.