Este protocolo ofrece una plataforma con etiqueta de biotina para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos que resulta ser robusta, confiable, eficiente y asequible. El mismo lote de los ácidos nucleicos con etiqueta de biotina se puede utilizar durante un largo período de tiempo, manteniendo la reproducibilidad de los experimentos. Por último, todos los ensayos con biotina-etiquetado descritos aquí se pueden realizar dentro de un día y no requieren equipo especial.
Demostrando el procedimiento estará Lina Yu, un postgraduado de nuestro laboratorio. Preparar construcciones MEIOB y MOV10, y transformarlas en las bacterias apropiadas. Para extraer MEIOB, peletiza las células a través de centrifugación y resuspendlas en 20 mililitros de solución salina tamponada de Fosfato de Dulbecco, o Tampón DPBS.
Sonicar la suspensión bacteriana sobre hielo. Luego, centrifugar el izado a 12.000 veces g y cuatro grados Celsius durante 15 minutos, y transfiera el sobrenadante a un tubo fresco. Pre-lavado de cuentas de glutatión-sepharose, y incubar con el ésate a cuatro grados Celsius durante dos horas.
Centrifugar la mezcla a 750 veces g y cuatro grados Celsius durante un minuto para peletizar las perlas. Enjuague las cuentas con 10 mililitros de PBS helado ocho veces. Luego, agregue un mililitro de tampón de elución, incubar las cuentas a cuatro grados Celsius durante 10 minutos, y eluir las cuentas a través de la centrifugación.
Repite la elución seis veces, y agrupa las seis fracciones. Transfiera las proteínas eluidas a un filtro centrífugo y concéntrese por centrifugación a 7.500 veces g para un volumen final de 100 a 200 microlitros. Para extraer MOV10, expresar la proteína en células HEK293T y peletizar las células de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Resuspender el pellet en tres mililitros de tampón de lelisis celular con cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA completo, e incubar durante 30 minutos sobre hielo. Luego, centrifugar el izado a cuatro grados centígrados. Prepare perlas magnéticas anti-FLAG lavándolas dos veces con tampón K150.
Después del lavado, resuspender las cuentas en un mililitro de tampón K150 helado y incubarlas durante dos minutos a cuatro grados centígrados con rotación suave. Recoger las cuentas en un imán, y quitar el sobrenadante. Agregue las cuentas al lesato celular e incubar a cuatro grados centígrados durante dos horas.
Lave las perlas con Tampón K150 de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y resusppend las cuentas en 300 microlitros de tampón de elución FLAG. Coloque las perlas en un imán, recoja el sobrenadante con las proteínas MOV10 y determine la concentración de proteínas. Preparar los oligonucleótidos de ARN diluyendo cada oligo a 20 micromolares y recocido para formar dúplex de ARN de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Para el ensayo de cambio de movilidad electroforética MEIOB, o EMSA, mezcle los reactivos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Añadir agua para un volumen de reacción final de 20 microlitros. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego añadir 5x tampón de parada.
Para el ensayo de actividad de helicasa MOV10, mezcle los reactivos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y agregue agua para un volumen de reacción final de 20 microlitros. Incubar la reacción a 37 grados centígrados durante 10 minutos, 30 minutos y 60 minutos, y luego añadir 5x tampón de parada para detener la reacción. A continuación, prepare un gel de poliacrilamida nativo del 20% y cargue de 20 a 25 microlitros de cada muestra en cada pocóyo.
Ejecuta el gel a 100 voltios en un baño de hielo hasta que el marcador azul de bromofenol haya migrado al cuarto inferior del gel. La acrilamida es dañina y tóxica. Es importante manejarlo con el equipo de protección personal adecuado.
Desmontar las placas de gel, y recortar el gel mediante la eliminación de los pozos de carga y carriles no utilizados. Coloque el gel en un tampón TBE de 0,5x. Corte el papel del filtro y la membrana de nylon al tamaño del gel, humedezca previamente el papel y la membrana, y ensamble la pila para su transferencia.
Transfiera las muestras del gel a la membrana en un aparato electroforético semisequedo a 90 miliamperios durante 20 minutos. Luego, entrecruza las muestras irradiando la membrana a 120 mililijoules por centímetro cuadrado durante 45 a 60 segundos. Para la detección de quimiuminoscencia, comience agregando 20 mililitros de tampón de bloqueo a la membrana e incubando durante 15 a 30 minutos mientras agita suavemente.
Retire cuidadosamente el búfer de bloqueo y reemplácelo por búfer conjugado/bloqueo. Incubar la membrana de nuevo durante 15 minutos. Lave la membrana cuatro veces mientras agita durante cinco minutos por lavado.
Luego, agregue 30 mililitros de tampón de equilibrio de sustrato a la membrana, e incubarlo durante cinco minutos mientras agita a 20 a 25 rpm. Cubrir toda la superficie de la membrana con solución de trabajo del sustrato, e incubar durante cinco minutos. Después de la incubación, escanee la membrana en un sistema de imágenes quimiominiscentes durante uno a tres segundos.
La purificación de las proteínas MEIOB A, C y E se puede verificar con la tinción azul de Coomassie y el análisis de manchas occidentales. Las flechas rojas indican las posiciones de las proteínas MEIOB purificadas. Las interacciones de MEIOB y adn de una sola cadena se pueden visualizar utilizando EMSA.
Se observan la unión dependiente de la concentración y el escote. Como era de esperar, sólo el tipo salvaje MEIOB-A interactúa con el ADN, mientras que el mutante MEIOB-E y MEIOB-C no lo hacen. También se pueden observar interacciones de MEIOB y ARN de una sola cadena.
La MEIOB de tipo salvaje muestra la unión dependiente de la concentración y la actividad de la exonucleasa en el ARN de una sola cadena. Sin embargo, la comparación cuantitativa muestra que MEIOB une el ADN con una eficiencia mayor que el ARN. La purificación de MOV10 se verificó con la tinción azul de Coomassie, y la actividad helicasa de la proteína se midió en un dúplex de ARN con un voladizo de cinco primos.
A medida que aumenta el tiempo de reacción, MOV10 desenrolla progresivamente el ARN de doble cadena. Para reducir el costo del ensayo, la detección de quimiuminescencia se puede realizar con una dilución doble de los reactivos del kit de detección o con reactivos hechos a sí mismos. El protocolo descrito aquí utilizó con éxito ácidos nucleicos con etiqueta de biotina como sustratos para ensayos bioquímicos in vitro como EMSA y para reacciones enzimáticas en las que la biotina no se ha utilizado comúnmente.
