Este método combina la capacidad de manchar una proteína de membrana al mismo tiempo que preserva la integridad de la membrana y la arquitectura subcelular. Así que es realmente potente para localizar con precisión una proteína asociada a la membrana. La principal ventaja de esta técnica es que combina el uso de una etiqueta robusta clonable genéticamente, APEX2, con métodos de vanguardia en preservación celular para microscopía electrónica, incluyendo criofija y sustitución por congelación.
Juntos, permiten una localización precisa de proteínas dentro de una célula bien conservada. Este protocolo se puede utilizar para diseccionar mecanismos mediante los cuales los virus se replican dentro de la célula host. Los virus a menudo secuestrarán las proteínas del huésped durante su esquema de infección.
Los virus son los pequeños genomas, que utilizan para replicar dentro de estas células huésped. Recientemente, hemos sido capaces de en datos no publicados, etiquetar estas proteínas utilizando esta tecnología para entender cómo se replican los virus. Esta técnica resultó muy crítica en un estudio colaborativo reciente sobre una toxina bacteriana que causa la descomposición del golgi.
Usando cryoAPEX, pudimos localizar con precisión la toxina con las piezas golgi fragmentadas, algo que era realmente difícil de ver de otra manera utilizando técnicas normales de inmunofluorescencia. Demostrando esta técnica estará Elaine Mihelc, una estudiante graduada y investigadora asociada, Stephanie Angel, de nuestros laboratorios. Después de sembrar células HEK293 en el plato, transfeque las células con plásmidos de expresión de mamíferos etiquetados con plasmidos de expresión de mamíferos utilizando reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
A las 12-15 horas después de la transfección, lave las células una vez con PBS. Luego, lave las células con PBS del plato en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar a 500 x g durante cinco minutos.
Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de 2%glutaraldehído y 0,1 molar sódico de cacodilato a pH 7,4 a temperatura ambiente. Coloque la muestra sobre hielo para incubar durante 30 minutos. Luego, pele la muestra a 500 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Lave el pellet tres veces durante cinco minutos cada uno con dos mililitros de 0,1 molar sódico de cacodilato centrifugando a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante. Para llevar a cabo la reacción de peroxidasa, lavar el pellet mediante la re-suspensión en tres mililitros de solución DAB seguido de peletización a 500 x g durante cinco minutos.
A continuación, vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de solución DAB con 5,88 peróxido de hidrógeno milimolar. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. El pellet se vuelve visiblemente de color marrón, lo que indica la presencia del producto de reacción DAB insoluble.
Después de lavar de nuevo con tampón de cacodilato de sodio en DMEM, según el manuscrito, vuelva a suspender el pellet celular en 500 microlitros de una solución crioprotectora de DMEM que contenga un 10% de suero bovino fetal y un 15% de albúmina sérica bovina. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Pellet de nuevo, aumentando ligeramente la velocidad de la centrífuga de 500 x g.
Deseche la mayoría del sobrenadante, asegurándose de que quede suficiente líquido para que el pellet no se seque. Wick lejos de cualquier líquido restante de la célula pellet usando la esquina de una toallita de laboratorio o toalla de papel. Deje que quede suficiente líquido que el pellet forma una pasta, similar en consistencia a la pasta de dientes.
Aspirar de dos a tres microlitros del pellet celular y depositarlo en un portador de membrana. Llene el pozo del portador de membrana completamente para que la tensión superficial cree una ligera cúpula en la parte superior. Deslice el portador de membrana en el cartucho y asegúrelo.
Coloque el cartucho en la máquina HPF que se ha preparado y preparado y pulse para empezar a congelarse. Manteniendo los cartuchos sumergidos en nitrógeno líquido, retire el portador de membrana de su cartucho. Colocar en una cápsula de plástico y colocar la cápsula de plástico en un Cryovial lleno de nitrógeno líquido.
En una capucha química, preparar un mililitro por muestra de la solución de 0.2% de peso por volumen ácido tánico y 5%DI agua en acetona en un Cryovial. Colóquelos en nitrógeno líquido para congelarlos. Coloque la mezcla de sustitución de congelación de un vial y los Cryovials que contienen los pellets de células congeladas en la cámara de muestra de las unidades de sustitución de congelación.
Transfiera la cápsula interna que contiene el portador de membrana del vial de nitrógeno líquido al vial correspondiente que contiene la mezcla de sustitución de congelación. Inicie un protocolo de sustitución por congelación a 90 grados Centígrados. Después de 24 horas, detenga la sustitución de congelación y lave las muestras tres veces durante cinco minutos con acetona que se ha enfriado a 90 grados centígrados.
A continuación, en una capucha química, preparar un mililitro por muestra de una solución de 1%tetróxido de osmio, 0,2%acetato de uranilo y 5% DE DI agua en acetona en un Cryovial y colocarlos en nitrógeno líquido para congelar. Coloque los Cryovials con la mezcla de sustitución de congelación dos en la unidad de sustitución de congelación y transfiera las cápsulas del tercer lavado de acetona a la mezcla de sustitución de congelación de dos viales. Incubarlos y congelar la mezcla de sustitución dos durante 72 horas a 90 grados Celsius, seguido de calentamiento gradual a cero grados Celsius durante 12-18 horas.
Mantenga la temperatura a cero grados Centígrados y agregue acetona preenfriada en los viales para lavar tres veces durante 10 minutos cada uno. Preparar una mezcla de resina de elección en un vaso de precipitados de plástico de acuerdo con las instrucciones del fabricante y añadir 2%4% y 8% de resina en los viales para sumergir las cápsulas. Incubar durante dos horas cada una a cero grados centígrados.
Luego, incubar en 15%30%60%90%y 100%componentes de resina de A, B y D sólo durante cuatro horas cada uno a temperatura ambiente. Después de las 20 horas, preparar una mezcla de componentes de resina A, B, C y D e incubar durante cuatro horas. Coloque los portadores de membrana con el lado del pellet celular hacia arriba en moldes de incrustación plana y llene con la mezcla de resina A, B, C y D.Colóquelos en un horno para polimerizarlos a 60 grados Celsius durante 24-36 horas.
Después de la polimerización, retire los bloques del molde y coloque la muestra en el mandril vertical del microtomo ultra donde se puede visualizar con aumento. Separe el portador de membrana del bloque mediante una combinación de nitrógeno líquido en el portador de membrana para separar el metal del plástico, y el uso de una cuchilla de afeitar para astillar la resina alrededor del portador de membrana. Cuando esté separado, levante suavemente el portador de la membrana, dejando la cúpula del pellet celular en la cara del bloque.
Coloque el bloque con el pellet de celda expuesto mirando hacia arriba en un molde de incrustación plana que es ligeramente más profundo que el primer molde y llene con componentes de resina A, B, C y D.Polymerize a 60 grados Celsius durante 24-36 horas. Recorte el bloque alrededor del pellet de la célula usando una cuchilla de afeitar. A continuación, coloque el bloque en el portabrocas de muestra en el brazo de seccionamiento de un microtoma ultra.
Usando un cuchillo de vidrio o diamante, recorte el bloque en una forma trapezoidal que rodea estrechamente el pellet celular. Obtenga secciones ultradelgadas de 90 nanómetros del pellet celular con un cuchillo de vidrio o diamante. Recoja una cinta de secciones en una cuadrícula TEM.
Seque la rejilla hinchando el borde de un pedazo de papel de filtro y guárdelo en una caja de almacenamiento de rejilla TEM. Monte la rejilla en el soporte TEM y coloque el soporte en el microscopio. Utilice un Tecnai T12 a 80 kilovoltas para la detección de muestras crioAPEX.
Adquiera imágenes de celdas y estructuras subcelulares de interés con el etiquetado APEX2. En este estudio, la preparación de la muestra por métodos tradicionales de APEX dio lugar a un etiquetado claro de estructuras de retículo endoplasmáticos organizadas y lisas. A un alto aumento, las membranas apiladas aparecieron con volantes y las brechas no uniformes estaban presentes entre las densidades de membrana concéntricas, lo que indica una mala preservación de la membrana y la extracción de lípidos.
La muestra preparada por cryoAPEX también tenía un etiquetado claramente definido de estructuras de retículo endoplasmáticos organizadas y lisas, sin embargo, las membranas eran lisas y paralelas y se veía poca o ninguna extracción de lípidos. El análisis TEM de secciones delgadas de 90 nanómetros reveló que la proteína E que interactúa con la levadura Huntington estaba presente en todo el retículo endoplasmático periférico, así como en la envolvente nuclear. Además, la densidad de proteína E que interactúa con la levadura Huntington se resolvió en focos espaciados regularmente a lo largo de la membrana del retículo endoplasmático luminal.
La levadura de Huntington que interactúa con la distribución de proteínaS E y los focos también fueron visibles en una muestra preparada con fijación tradicional y deshidratación. Sin embargo, se presentaron una extensa interrupción y extracción de la membrana, por lo que la muestra era subóptima. El etiquetado APEX2 se realizó utilizando tres marcadores celulares, de los cuales mito-V5-APEX2 proporcionó una tinción específica de las mitocondrias solamente y CAAX-APEX2 produjo una tinción distinta de la membrana plasmática solamente.
No se observó etiquetado en orgánulos intracelulares. La tinción para el lumen golgi también se evaluó utilizando un marcador Alpha MAN2-APEX2 como se describe en nuestro manuscrito original de Sengupta et al. Después de este procedimiento, se pueden realizar métodos tridimensionales como la tomografía electrónica o la microscopía electrónica de barrido de haz iónico focalizado para investigar la distribución 3D de una proteína de interés.
Muchos de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos, por lo que antes de su uso, las fichas de datos de seguridad deben ser consultadas para garantizar que los productos químicos se manipulan utilizando el equipo de protección personal adecuado y se eliminan de acuerdo con las directrices institucionales.
