Este método mantiene muestras biológicas en un entorno nativo y reduce el artefacto inducido por haz de electrones. La principal ventaja es que esta técnica es aplicable a células enteras. Por lo tanto, las células no necesitan deshidratarse, mancharse o seccionarse antes de la microscopía electrónica.
La capacidad de imaginar receptores en las células cancerosas en el contexto de toda la membrana plasmática intacta es un aspecto importante que puede conducir a nuevos enfoques terapéuticos y el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer. Demostraré el trabajo con células, revestimiento de grafeno y microscopía, y Sercan Keskin mostrará cómo preparar el grafeno. Para empezar, añada 100 microlitros de suspensión celular a dos pocillos de una placa de 96 pozos que contenga microchips recubiertos de PLL y FLP con la membrana de nitruro de silicio hacia arriba y 50 microlitros de medio libre de suero.
Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos para permitir que las células se adhieran al microchip. Compruebe la densidad de las células del microchip con un microscopio invertido y asegúrese de que las células cubran la ventana con suficiente espacio para aplanarse y adherirse. Para etiquetar HER2 en las células, coloque los microchips en los pocillos de la primera fila de la placa de etiquetado.
Luego, lave los microchips con PBS BSA. Para evitar la unión inespecífica del anticuerpo mimético, incubar los microchips con PBS BSA GS durante cinco minutos. Luego con 200 anticuerpos nanomolares miméticos durante 10 minutos a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono.
Para eliminar el grafeno PMMA del polímero, pipetee unas gotas de agua en el polímero alrededor del grafeno PMMA. Luego, sumérgelo en agua con un ángulo de 30 a 45 grados para liberar el grafeno PMMA. Para grabar contaminantes a base de cobre, anteponga una solución de 50 mililitros de persulfato sódico molar de 0,42 molares en agua.
Utilice una corredera de vidrio estándar para transferir el grafeno PMMA a la solución de persulfato de sodio con el lado del grafeno hacia abajo. El grafeno PMMA flotará hasta la parte superior de la solución. Déjalo ahí toda la noche.
Al día siguiente, transfiera el grafeno PMMA de la solución de persulfato sódico a agua limpia. Déjalo flotar en el agua durante media hora. Repita el lavado un total de tres veces para eliminar todos los residuos de persulfato de sodio del grafeno PMMA.
A continuación, transfiera el grafeno PMMA a un cristal de cloruro de sodio. Preparar una solución saturada de cloruro de sodio en agua en una placa Petri y transferir el grafeno PMMA en la parte superior de la solución con el lado del grafeno hacia abajo. Sostenga el cristal de cloruro de sodio con pinzas y recoja el grafeno PMMA flotante.
Luego, sostén lo sostenga verticalmente durante dos minutos para dejar que el exceso de agua fluya. Dejar secar a temperatura ambiente durante 30 minutos y hornearlo en un horno a 100 grados Celsius durante 20 minutos. Retire completamente el agua.
Precaliente la acetona en un plato de Petri de vidrio a aproximadamente 50 grados Celsius en una placa caliente en la campana de humo. Observe la temperatura cuidadosamente para evitar el fuego. Sumerja el grafeno PMMA sobre sal en el plato de Petri lleno de acetona y déjelo disolver el PMMA durante 30 minutos.
Deje que el grafeno en sal se seque a fondo antes de usarlo para la preparación de la muestra. Lave un microchip preparado y etiquetado en agua pura para eliminar los residuos de sal del tampón y colóquelo en el papel de filtro. Las células deben ser visibles como manchas oscuras.
Utilice una cuchilla de afeitar para cortar el grafeno multicapa en el cristal de cloruro de sodio en una pieza que se ajuste a la ventana de nitruro de silicio de un microchip. Retire el grafeno del cristal de cloruro de sodio sumergiéndolo en un vaso de agua, inclinando el cristal en un ángulo de 45 grados con respecto a la superficie. Atrapa el grafeno con un lazo metálico de la superficie del agua, luego toca la superficie superior del microchip con la superficie del lazo inferior, haciendo que el microchip se pegue al lazo metálico.
El grafeno se puede ver en la parte superior del microchip. Bajo un estereomicroscopio, utilice papel de filtro para eliminar el agua restante del microchip de modo que el grafeno cubra todas las celdas de la ventana de nitruro de silicio. Coloque el microchip sobre un papel de filtro con pinzas.
El grafeno es visible como un brillo púrpura en el microchip. Transfiera el microchip del papel a un compartimento De Petri. Pipetear una gota de agua en uno de los compartimentos libres y cerrar la tapa para proporcionar una atmósfera saturada de agua.
A continuación, selle el plato del compartimiento con película de parafina y guárdelo en la nevera a cuatro grados centígrados. Ajuste el STEM a 200 kilovoltas de energía utilizando una muestra de alineación para un tamaño de sonda de al menos 0,2 nanómetros ajustando las lentes del condensador. Establezca una corriente de sonda de 180 Picoampere y un semiángulo de convergencia de haz de 13,2 milradios insertando una abertura.
Ajuste el rango de semiángulo de apertura del detector ADF STEM en 68 a 280 milándirios ajustando la configuración de la lente del proyector. A continuación, establezca el tamaño de la imagen STEM en 2048 por 2048 píxeles y el tiempo de permanencia de píxeles en seis microsegundos. Cargue el microchip con células recubiertas de grafeno en un soporte de muestra estándar para tem de tal manera que las células estén mirando hacia arriba y cargue el soporte en el microscopio electrónico.
Adquiera una imagen general con un aumento de 800 X. A continuación, identifique una región de interés e imagen de las nanopartículas de puntos cuánticos a 80.000 X con un tamaño de píxel de 1,3 nanómetros. Las células de semillas óptimas se muestran aquí.
La ventana está cubierta, pero hay suficiente espacio para permitirles aplanarse y adherirse. Cuando se sembraron demasiadas células en un microchip, no había suficiente espacio para que todas las células se adhieran. Después de 24 horas, más de la mitad de las células no se aplanó.
Si se siembran muy pocas celdas, la ventana de nitruro de silicio terminará con un gran espacio vacío después de 24 horas. Las imágenes DIC y fluorescencia de las células de semilla óptima se muestran aquí, lo que demuestra el etiquetado exitoso de HER2. STEM se realizó en células SKBR3 recubiertas de grafeno y no recubiertas.
Los recuadros de las imágenes de aumento de 800 X se imáron a 80.000 X.Las nanopartículas de puntos cuánticos son visibles como puntos brillantes con un aumento de 50.000 X. Para investigar el efecto de la iluminación de haz de electrones en la muestra, se adquirieron imágenes STEM en una serie de imágenes con una dosis de electrones acumulada. Aquí se muestran resultados representativos de muestras no recubiertas y recubiertas de grafeno.
La exposición de muestras no recubiertas dio lugar a estructuras brillantes que aparecieron en las superficies celulares, lo que no se produjo con ninguna de las muestras recubiertas de grafeno. El cambio de distancia relativa promedio de los pares de partículas se mantuvo por debajo del 1,3% para las muestras no recubiertas y por debajo del 0,8% para las muestras recubiertas. Después de este procedimiento, se pueden obtener diferentes tipos de proteínas de membrana en células enteras utilizando otros métodos de microscopía.
Esta técnica permite la imagen de proteínas en la membrana plasmática intacta para obtener más información sobre la organización de la membrana plasmática y la interacción entre proteínas.
