Las nanosondas de fluorescencia de rayos X sincrotrón de nuevo diseño permiten visualizar la distribución elemental de una muestra. El uso de enfoques criogénicos es obligatorio para reducir la velocidad de los daños por radiación de rayos X. Por lo tanto, una criofija rápida es esencial para obtener células hidratadas congeladas para optimizar la preservación de la estructura celular y su integridad química.
La especificidad de las preparaciones celulares para estudios de sincrotrón conducen a la optimización de este protocolo para la adquisición de monocapas de células hidratadas congeladas. La demostración visual es importante para entender cómo manipular las muestras monocapa de celdas para lograr células criofijas reproduciblemente incrustadas dentro de una fina capa de hielo. Para preparar un soporte de membrana de nitruro de silicio, abra la cápsula que contiene el soporte de la membrana y apriete suavemente la cápsula para aflojar ligeramente el soporte.
Utilice pinzas delgadas para agarrar una esquina del marco de silicio teniendo cuidado de no tocar la membrana de nitruro de silicio en el centro del marco y colocar el marco en una placa Petri descubierta en un gabinete de flujo laminar. Luego, los rayos UV esterilizan la membrana durante 25 a 30 minutos. Al final de la esterilización, añadir 10 microlitros del factor de fijación como poli-L-lisina.
Incubar durante 25 minutos a 37 grados centígrados y al 5% de dióxido de carbono con humedad. A continuación, llene los pozos de una placa estéril de 48 pozos con 200 a 250 microlitros de 0,22 micrómetros filtrados ultra puro y ultra traza de agua por pozo. Utilice pinzas finas para sumergir cuidadosamente la membrana verticalmente con tres enjuagues sucesivos de 10 segundos en un pozo de agua.
Después de enjuagar, coloque la membrana verticalmente en un pozo vacío de una placa estéril de 96 pozos debajo de la campana de flujo laminar y déjela durante la noche hasta que esté seca. Para la siembra de las células de interés, coloque la membrana recubierta con el lado plano hacia arriba en un pozo de una placa estéril de cuatro pozos. Añadir cinco veces 10 a las cuatro células en 10 microlitros de un medio de cultivo apropiado a la superficie de la membrana de nitruro de silicio sin tocar la membrana.
La gota debe cubrir toda la membrana. Luego cultiva las células a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono con humedad. Cuando las células han comenzado a adherirse al sustrato, añadir lentamente un mililitro de medio de cultivo completo por la pared de cada pozo que cubre cada membrana.
Luego cultiva las células a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono con humedad. Para la criomamovilización de la preparación celular, primero encienda un congelador de inmersión automático y llene el número adecuado de pozos en una placa de plástico de 12 pozos con tampón de acetato de amonio de 37 grados Celsius. Inmediatamente antes de enjuagar y congelar la membrana, retire la muestra de la incubadora y utilice el anillo de abrazadera negro de un par de pinzas de liberación rápida para desbloquear las pinzas.
Utilice las pinzas desbloqueadas para agarrar el soporte de membrana y sumergir la membrana verticalmente dentro de la solución tampón de acetato de amonio durante unos cinco segundos. Para eliminar cualquier exceso de tampón, presione la parte inferior del soporte de membrana sobre el papel del filtro y borre cada lado del marco sobre el papel del filtro sin permitir que la membrana toque el papel. Cuando se haya eliminado el exceso de búfer, abra la puerta de la cámara ambiental, deslice rápidamente las pinzas en el enclavamiento de fórceps y cierre la puerta de la cámara.
Pulse Blot A plunge. Las pinzas que sostienen la membrana de nitruro de silicio se sumergirán rápidamente en el criogeno. Después de la congelación por inmersión, retire la tapa del recipiente de transferencia con fórceps preenfriados y la transferencia de prensa.
La membrana de nitruro de silicio se moverá ligeramente por encima del criogeno. En un solo movimiento rápido, deslice e incline ligeramente las pinzas fuera del enclavamiento de fórceps para llevar las pinzas directamente en una ranura vacía de la criobox en el recipiente de transferencia lleno de líquido de nitrógeno. A continuación, suelte el anillo de abrazadera negro para liberar la membrana.
Para el secado por congelación de las células congeladas por inmersión, utilice el interruptor basculante situado en el panel posterior del instrumento de secado por congelación para encender el instrumento. La pantalla mostrará pulse intro cuando esté listo para cargar la muestra. Monte el soporte de latón de membrana de nitruro de silicio en la parte superior del soporte de transferencia de muestra proporcionado por el proveedor en el contenedor de almacenamiento de poliestireno manteniendo el nivel de nitrógeno líquido a aproximadamente uno a dos milímetros por debajo del borde superior de la primera pieza de latón.
Coloque la membrana con el lado de la muestra de celda hacia arriba en la cavidad numerada del soporte de latón y pre-enfríe la varilla de transferencia en una caja de espuma de poliestireno lleno de nitrógeno líquido. Utilice la varilla para fijar el conjunto completo, presione enter para romper el vacío para liberar la tapa de la cámara de secador de congelación, transfiera inmediatamente la muestra en la cámara de secador de congelación y cierre la tapa de la cámara de congelación. A continuación, pulse inmediatamente start para continuar con el ciclo de secado por congelación.
Al final del ciclo de secado por congelación, presione stop para ventilar la cámara y retire el conjunto completo para acceder a las muestras liofiladas. Aquí se muestra una vista típica del microscopio óptico de video microscopio de células de línea celular hidratadas congeladas subcultadas en un soporte de membrana de nitruro de silicio recubierto de poli-L-lisina como se ha demostrado. El mapeo elemental de fluorescencia de rayos X de las células hidratadas congeladas revela las distribuciones de elementos fisiológicos como potasio, azufre y zinc.
En este ejemplo representativo, el elemento de azufre estrechamente unido se distribuyó uniformemente dentro de la célula en un patrón similar al observado para el potasio y representa una buena estimación del perfil de masa celular. La distribución del zinc, sin embargo, exhibió una señal más alta dentro del núcleo que en el citosol con una separación claramente definida de la señal entre el citosol y el núcleo. En esta vista típica de microscopía de Brightfield de las neuronas hipocampales primarias de ratón liofilizados cultivadas directamente en una membrana de nitruro de silicio como se ha demostrado, las células exhiben una morfología neuronal típica que no se ve afectada por su cultivo o método de preservación.
Las imágenes de fluorescencia de rayos X de las células congeladas por inmersión también revelan distribuciones elementales típicas que exhiben estas células liofilizadas representativas con una resolución espacial de 50 a 100 nanómetros. Trazar la ventana de nitruro de silicio es fundamental para obtener la capa de hielo más delgada posible de las células después de la congelación por inmersión. La preservación de la integridad química de las células a nivel subcelular permite explorar el metaloma de las células con nanosondas de sincrotrón, así como con otras técnicas microanalíticas.
Como no todos los análisis de nanosondas de sincrotrón se pueden realizar a temperatura criogénica, las células hidratadas congeladas se pueden liofilizar aún más para facilitar su análisis a temperatura ambiente. Recuerde utilizar el equipo de protección personal adecuado cuando trabaje con nitrógeno líquido y utilizar siempre gas etano en una campana de humo lejos de las llamas.
