La técnica de rastreo descrita en este protocolo nos ayuda a estudiar la morfogénesis neuronal y a romper la conectividad en el sistema de neuronas motoras de Drosophila. El tinte lipofílico puede difundirse rápidamente en cada parte de la membrana celular con una densidad extremadamente alta. Esta es la razón por la que nuestro protocolo se resuelve eficientemente para encontrar estructuras de una neurona etiquetada.
Si se puede acceder a un terminal de axón con una micropipeta de inyección, esta técnica podría aplicarse a cualquier neurona en las etapas larvarias y adultas de las moscas o en otros organismos. Si no tiene experiencia diseccionando o utilizando un microinyector preciso la operación en la muestra, puede ser difícil. Comprender la anatomía del embrión, ayudará con la orientación a la porción adecuada de herramientas para llevar a cabo la disección o una inyección.
Para empezar, preparar y diseñar todos los materiales de recolección de embriones. Prepare el aparato de filtración cortando un tubo de 50 mililitros y abriendo un agujero en la tapa. A continuación, establezca un filtro de malla con poros de 100 micrómetros entre el tubo y la tapa.
Prepare la micropipeta de inyección de tinte y la aguja de disección del mismo tubo capilar con un diámetro interior de 1,2 milímetros. Tire del tubo con una micropipeta, tire al 7% de la salida máxima de 170 voltios para crear una aguja afilada con un cónico de aproximadamente 0,4 centímetros de longitud. Para preparar la micropipeta de inyección de tinte, remoje la amoladora con un agente humectante y coloque la aguja en la abrazadera de micropipeta a 25 a 30 grados.
A continuación, baje la punta en dos tercios del radio desde el centro de la superficie biselada. Moler la aguja mientras una jeringa con tubo empuja el aire hacia ella. Marque la micropipeta con un marcador permanente de punta fina para indicar la posición de la abertura en la punta después del biselado, ya que puede ser difícil localizar la abertura estrecha que se forma en un ángulo.
Deje que las moscas pongan huevos durante la noche a temperatura ambiente y recoja la pipa con los huevos por la mañana. Para recoger los embriones, desclorina los huevos en la placa con 50% de lejía durante cinco minutos. Una vez que los cloriones se hayan despejado, vierta el contenido de la placa a través del aparato de filtración o colador celular para aislar los embriones.
Utilice una botella de agua para diluir la lejía que queda en la placa y reunir tantos embriones como sea posible decantando la mezcla en el filtro. Lave los embriones de tres a cuatro veces con agua hasta que el olor a lejía se disipe. Retire el filtro del aparato y lávelo en otra placa limpia con agua.
A continuación, decantar el agua de la nueva placa en la que están los embriones. Utilice fórceps finos para seleccionar de cinco a 10 embriones a las 15 horas después de la puesta del óvulo y colóquelos en cinta adhesiva de doble cara con el lado dorsal hacia arriba. Agregue la solución salina del marcador de insectos a la piscina de disección para proteger los embriones de la desceración.
Utilice una aguja de vidrio bajo un microscopio de disección para arrastrar el embrión fuera de la membrana de inclinación media de la cinta al vidrio, teniendo cuidado de no dañar los tejidos interiores del embrión. Luego corta a través de la línea media de un solo embrión en su superficie desde su extremo posterior hasta el extremo anterior. Voltee los tejidos epiteliales desde el centro y conecte el borde epidérmico sobre la superficie del portaobjetos de vidrio.
Utilice una aguja conectada al tubo con una abertura de punta de unos 300 micrómetros para aspirar o soplar aire para extraer los troncos traqueales longitudinales dorsales, así como los intestinos restantes. Utilice 4%PFA y PBS para fijar los embriones durante cinco minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital. A continuación, lávelos tres veces con PBS.
Mancha los embriones con un microlitro de anticuerpo antirábano peroxidasa conjugado con tinte Cyanine3 y 200 microlitros de PBS durante una hora en el agitador orbital. Y repite los lavados en PBS. Para llenar la micropipeta de inyección, colóquela en el soporte capilar.
A continuación, coloque el tinte deslizar en el escenario y utilice el micromaniprógrafo para colocarlo sobre la diapositiva. A continuación, ajuste el escenario para colocar la micropipeta en el tinte. Recoger el tinte en la micropipeta ajustando la presión de inyección a entre 200 y 500 hectopascal, el tiempo de inyección entre 0,1 y 0,5 segundos y la presión de compensación a cero durante cinco minutos.
Una vez recogido el tinte, retire el tobogán del tinte y coloque la muestra en la etapa del microscopio. A continuación, aumente la presión de compensación a un rango de 30 a 60 hectopascale y baje la micropipeta en la muestra. Utilice la lente objetivo 10 veces para localizar el embrión y alinear la micropipeta con el embrión.
Cambie la lente objetivo a una lente de inmersión en agua 40 veces. Y sumerge la lente en el PBS. Utilice microscopía de fluorescencia para comprobar la morfología neuronal marcada por anti-HRP Cy3 y determinar el lugar de inyección.
Cuando el embrión está enfocado, cambie la posición de la micropipeta para hacer contacto suave con la punta del axón de interés. A continuación, utilice una microscopía de campo brillante durante la inyección para ver la gota de tinte. Suelte el tinte en el hemisegmento abdominal derecho en la unión neuromuscular de aCC o RP3 con DiD o DiO.
Utilice el control manual para liberar el tinte y retirar la micropipeta. A continuación, pase al siguiente lugar de inyección. Incubar la muestra durante una hora a temperatura ambiente en un agitador orbital antes de la toma de imágenes.
Con fórceps finos, retire las cintas de la corredera de vidrio. Para montar la muestra, prepare un resbalón de cubierta con una pequeña cantidad de grasa al vacío en las cuatro esquinas. Lo colocó cuidadosamente en la muestra, asegurándose de evitar las burbujas de aire.
Empuje hacia abajo el resbalón de la cubierta para ajustar el espacio de la muestra para permitir la distancia de trabajo entre la lente objetivo y la diapositiva. Elimine cualquier exceso de PBS con toallitas de tareas. Selle completamente los bordes del resbalón de la cubierta con esmalte de uñas.
Imagen a 10 veces y 100 veces la ampliación con un microscopio confocal y procesar las imágenes, con el software imageJ. Este protocolo se utilizó para retrógrado etiquetar la neurona motora aCC inervando músculo uno y la neurona motora RP3 inervando los músculos seis y siete. Las ramas dendríticas de las neuronas motoras ACC y RP3 muestran una superposición extensa.
Ambas neuronas son bipolares, estableciendo dos poblaciones diferentes de dendritas. Para demostrar las capacidades cuantitativas de este método, el número total de puntas de dendrita se contó en mutantes de tipo salvaje y Dscam1. Las dendritas ipsilaterales de aCC se muestran para el tipo salvaje, pero se observaron pocas dendritas ipsilaterales para el mutante Dscam1.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el tamaño de la gota de tinte es crucial, que es aproximadamente 10 a 20 micrómetros. Pruebe el tamaño en la cinta de doble cara y luego aplíquelo en el lugar de inyección. Usando este procedimiento, podemos aprovechar la propiedad foto conmutable de la sonda DiD para obtener imágenes de súper resolución de la membrana plasmática.
De esta manera podemos estudiar la caracterización ultra estructural de las membranas sinápticas en la unión neuromuscular. Hicimos el clic. Realizamos análisis fenotípicos de las dendritas de ACC en cepa mutante, y descubrimos que una inyección Dscam1-Dock-Pak define el sitio del crecimiento de dendrita en aCC.
