Este método se puede adaptar fácilmente para observar señales de otras proteínas fluorescentes o se puede utilizar para la imagen de axones en otro adulto La principal ventaja de esta técnica facilita una excelente reconstrucción tridimensional y visualización de los axones y sus árboles terminales. Comience llenando el número adecuado de pozos en una placa de vidrio multi-pozo con 70%etanol. Usa un cepillo para añadir de 15 a 20 moscas anestesadas de dióxido de carbono de cualquier edad o sexo a cada pozo y coloca suavemente las moscas en el etanol hasta que estén completamente sumergidas.
Después de no más de un minuto, enjuague las moscas tres veces con una solución de detergente tensioactivo 0,3% no iónico en solución salina tamponada con fosfato durante al menos 10 minutos por lavado. Después del último lavado, utilice fórceps para extraer la cabeza y el abdomen de cada mosca sin dañar el segmento torácico o las piernas y utilice la punta de un par de fórceps finos para aplicar suave pero firmemente presión sobre la unión coxa-tórax para separar una pierna del segmento torácico. Coloque las patas en un pozo de una nueva placa de varios pocillos que contenga 4%paraformaldehído recién preparado sobre hielo para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados.
Es importante empujar las patas suavemente en el tampón de fijación sin dejarlas flotar para obtener patas bien fijas. Al día siguiente, lave las piernas cinco veces en una solución de detergente tensioactivo 0.3% no iónico durante 20 minutos por lavado. Después del último lavado, sustituya el detergente por medio de montaje y mantenga las patas en el medio de montaje durante al menos 24 horas.
Al día siguiente, añadir aproximadamente 20 microlitros de 70% glicerol junto al extremo recubierto del portaobjetos del microscopio de vidrio y cubrir el glicerol con un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros. A continuación, añada aproximadamente 10 microlitros de medio de montaje a la derecha del cubreobjetos y aplique una segunda línea de 30 microlitrotros de medio de montaje a la derecha de la línea de 10 microlitro. Usando fórceps finos, transfiera una pierna de la placa multi-pozo en una gota de medio a la tira de 10 microlitrotro del medio de montaje en una orientación externa hacia arriba o hacia abajo.
Repita hasta que se hayan montado y alineado seis a ocho patas y coloque un segundo cubreobjetos sobre las patas de forma que el segundo cubreobjetos se apoye ligeramente en el primer cubreobjetos. A continuación, utilice esmalte de uñas en cada esquina de los cubreobjetos para asegurarlos en su lugar. Para crear imágenes de las patas, utilice el láser de 488 nanómetros y dos detectores simultáneamente para configurar la primera pista para obtener la fluorescencia automática GFP y cutícula.
Seleccione un objetivo de inmersión de aceite de 20 a 25 veces y establezca la resolución en 1024 por 1024 píxeles con una profundidad de 12 bits y establezca el espaciado z en un micrómetro. Cargue la diapositiva en la etapa del microscopio y utilizando la misma potencia láser para ambos detectores, ajuste la ganancia del primer detector para obtener una señal GFP brillante y ajuste el segundo detector para asegurarse de que algunas áreas con una señal de corte alta produzcan una señal saturada en este detector. A continuación, imagine las patas utilizando las opciones de mosaico o posición para capturar toda la pierna si una pierna está extendida o demasiado grande para ser imagen en un solo marco.
Para el procesamiento de imágenes, abra la pila confocal en ImageJ Fiji y utilice el complemento Bio-Formats para abrir cualquier imagen que no esté en formato TIFF. Para dividir los canales, seleccione Imagen, Color y Dividir canales. Para restar la señal de cutícula de la señal GFP, abra Process and Image Calculator y seleccione la pila del detector uno como imagen uno.
En la ventana de operación, seleccione restar y seleccione la pista del detector dos como imagen dos para que solo se obtenga la señal GFP endógena. Utilice Imagen, Pilas, Z Protect para generar la proyección de intensidad máxima para la señal GFP endógena. Utilice los controles de la ventana de control de brillo para ajustar el brillo y el contraste.
A continuación, genere una intensidad media para la cutícula, seguida de Los canales de imagen, color y fusión para fusionar la pila de GFP con la pila solo de cutícula adquirida del detector dos. Esto dará lugar a una imagen RGB compuesta por la señal GFP específica del tejido, así como la señal de cutícula para ayudar a identificar los árboles de axón dentro de los segmentos de la pierna. Para utilizar la macro, abra la pila confocal y haga clic en Imagen, Ajustar y Brillo/Contraste.
A continuación, haga clic en Plugin y Macro Run para ejecutar la macro y siga las instrucciones. Cuando se le pida que especifique la operación en la ventana de la calculadora de imágenes, seleccione la imagen uno como pila uno. En la ventana de operación, seleccione restar.
Seleccione la imagen dos como pila dos. Cuando se le pida que ajuste el contraste, utilice los controles en la ventana de control de brillo para ajustar el contraste de brillo de la imagen de proyección máxima de GFP y de la proyección media de la cutícula para generar una imagen combinada RGB de ambas señales que muestran la GFP en verde y la cutícula en gris. A continuación, combine los resultados de la pila uno y la pila dos para generar una GFP combinada y una pila de cutículas que se pueden utilizar en la siguiente etapa.
Para visualizar las patas en tres dimensiones, abra la pila RGB en un programa de software 3D adecuado. En la ventana de diálogo emergente, seleccione todos los canales en la sección de conversión de modo e introduzca el tamaño de un voxel obtenido del análisis anterior. En el módulo del canal uno, haga clic con el botón derecho y seleccione Pantalla y Volren.
A continuación, haga clic izquierdo en el módulo Volren. En la sección Propiedades, haga clic izquierdo en Avanzado y seleccione DDR. A continuación, ajuste el valor gamma para ver el fondo de la cutícula.
En el módulo de canal dos, haga clic con el botón derecho y seleccione Mostrar Volren. A continuación, haga clic izquierdo en el módulo Volren, Editar y seleccione volrenGreen.col. Mediante este procedimiento, la señal de la cutícula se puede combinar con la señal GFP para identificar el posicionamiento de los axones dentro de las patas.
Es de vital importancia obtener patas bien fijas. En las patas correctamente fijas, las estructuras internas dentro de las patas son de un color uniforme y las traqueas, que son oscuras, son visibles. En las piernas mal fijas, el material oscuro está presente en el tarso y la tibia y el sistema traqueal no es claramente visible en el fémur y la coxa.
El procedimiento que describimos aquí supera el desafío de detectar la expresión fluorescente en los axones de neuronas motoras a través de una cutícula fluorescente gruesa y automática con alta resolución. Así que la señal fluorescente limpia y detallada obtenida nos permite visualizar y cuantificar la característica tridimensional de los arbores de axón utilizando programas de imágenes 3D. Así que esta técnica nos permitirá utilizar Drosophila adulta como modelo no sólo para estudiar el desarrollo de la neurona motora, sino también para estudiar, para entender el impacto de la enfermedad degenerativa como ERAS en el sistema locomotor integrado.
