En el embrión temprano de Drosophila, muchos orgánulos experimentan movimientos a gran escala. Nuestro protocolo describe cómo monitorear este movimiento utilizando colorantes fluorescentes desarrollados para el cultivo celular. En comparación con las proteínas fluorescentes, las sondas fluorescentes disponibles comercialmente son más brillantes y abarcan una gama más amplia del espectro.
Permiten el colabeling multiplex y se pueden usar en cualquier fondo genético. Se necesita práctica y prueba y error para saber cuánto tiempo se desecan los embriones, de modo que estallen durante la inyección o se sequen y dejen de desarrollarse. Para comenzar, comience a preparar las agujas de inyección colocando el capilar en un soporte capilar en el extractor de agujas y asegurándolo con tuercas de ala.
Alinee el centro del capilar con el elemento calefactor. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, elija la configuración adecuada en el extractor de agujas. Usando un microscopio de disección, realice la prueba de control de calidad.
Presione las agujas en la masilla horizontalmente con las puntas de la aguja suspendidas en el aire. Cubra las agujas con la tapa y guárdelas hasta su uso. Usando puntas de carga de aguja unidas a una micropipeta, extraiga un microlitro de la solución de inyección en la punta sin atrapar burbujas de aire.
Con guantes, sostenga la aguja en una mano con la punta apuntando hacia afuera e inserte la punta de carga en ella. Dispense el líquido cerca de la punta de la aguja, retire la pipeta y sostenga la aguja verticalmente hasta que el líquido fluya hacia la punta. Cubra el recipiente con papel de aluminio sin dañar las puntas de la aguja para evitar el blanqueamiento de los tintes.
Usando una pipeta de transferencia, o un micropipetador, coloque una pequeña gota de pegamento de heptano en el centro de un resbalón de cubierta rectangular y deje que se evapore. Para eliminar el corion mecánicamente, cubra la placa embrionaria adecuadamente envejecida con una capa delgada de aceite de halocarbono 27 para que la cáscara del huevo sea transparente. Vea la placa bajo un microscopio de disección con iluminación trans para confirmar la etapa embrionaria y seleccionar los embriones en etapas de escisión.
Usando pinzas finas, recoja un embrión de la etapa deseada agarrando los apéndices dorsales y transfiéralo al portaobjetos de vidrio preparado cubierto con cinta adhesiva de doble cara. Coloque el embrión en la cinta y minimice la transferencia de aceite. Enrolle el embrión suavemente a través de la superficie de la cinta empujando con el lado de la punta de las pinzas sin pincharlo directamente.
Continúe enrollando el embrión hasta que el corion se adhiera a la cinta y se agriete. Después de que el corion se agriete, siga rodando el embrión para separarlo del corion, que permanece pegado a la cinta. Vuelva a enrollar el embrión sobre el corion, que es menos adhesivo que la cinta.
Frote suavemente el embrión con las pinzas hasta que se adhiera a las pinzas para su transferencia. Luego, transfiera el embrión al resbalón de la cubierta y póngalo en contacto con el pegamento para mantener el embrión en su lugar, separándolo de las pinzas. Ajuste la orientación del embrión en el resbalón de la cubierta.
Deje que los embriones se desecan durante cinco a 12 minutos colocando el resbalón de la cubierta con embriones en la cámara de desecación y sellándolo. Retire el resbalón de la cubierta de la cámara y coloque una gota de aceite de halocarbono 700, cubriendo los embriones para evitar una mayor desecación. Examínelos bajo el endoscopio de disección y proceda a la microinyección si los embriones fueron desecados correctamente.
Coloque el objetivo 4X en la trayectoria de la luz y, utilizando la perilla de enfoque en el microscopio, ajuste los embriones para enfocarlos. Mueva los embriones horizontalmente hacia el centro del campo de visión utilizando los controles de escenario. Mantenga los embriones en el borde del campo de visión y aléjelos en preparación para bajar la aguja.
Permaneciendo con el mismo plano focal, baje la punta de la aguja y asegúrese de que sea visible en el campo de visión junto con los embriones. Compruebe que la aguja está funcionando dispensando parte de la solución de inyección en aceite de halocarbono 700. Si tiene éxito, aparecerá una burbuja de solución en el aceite cerca de la punta de la aguja.
Usando los controles de etapa, mueva el embrión hacia la punta de la aguja hasta que la punta perfore suavemente el embrión y entre en él. Simultáneamente, comience el flujo de la solución inyectable hasta que aparezca un punto claro transitorio en el sitio de la punta de la aguja, lo que indica una transferencia exitosa de la solución al embrión. Asegure el deslizamiento de la cubierta en el microscopio confocal con el soporte deslizante.
Tenga cuidado ya que el deslizamiento de la cubierta es frágil. Inspeccione los embriones utilizando la función de epifluorescencia en el microscopio confocal con un objetivo 40X y asegúrese de que el fluoro 4 en el embrión sea visible antes de continuar. Para imágenes en vivo, durante las etapas sincitiales, establezca el tamaño de la imagen de 512 por 512 píxeles, un promedio de línea de tres y una velocidad de fotogramas de 0,1 fotogramas por segundo.
Después de inyectar el tinte BODIPY 493 503, se localizó en el sitio donde se insertó la punta de la aguja y luego se difundió adyacente al sitio de inyección. Después de 24 minutos, el tinte se ha difundido más allá del punto medio del embrión. La motilidad del orgánulo se monitorizó inyectando al embrión con BODIPY 493 503 y LysoTracker Red.
El análisis de velocimetría de imagen de partículas reveló que el contenido embrionario convergió en la región central del embrión, donde el citoplasma fluye hacia el interior del embrión. El etiquetado de la sala de emergencias, utilizando ER-Tracker Green, proporciona una resolución vívida de la envoltura nuclear, lo que permite la visualización de las principales etapas del ciclo celular. El embrión fue inyectado con MitoView 633 en la etapa de blastodermo y fotografiado cuatro horas después.
La imagen muestra una célula neuroectodérmica de un embrión en extensión de banda germinal. Se inyectó un embrión celularizante con una mezcla de BODIPY 493 503 y SiR Tubulin, que muestra que las gotas de lípidos se mueven bidireccionalmente a lo largo de los microtúbulos. El embrión debe ser parcialmente desecado para que se pueda inyectar líquido.
Muy poca desecación hará que el embrión se filtre cuando se inyecta, demasiada desecación matará al embrión. Los videos de orgánulos en movimiento se pueden caracterizar a través de diversas técnicas de análisis de imágenes. El seguimiento de partículas revela el comportamiento de orgánulos individuales, la velocimetría de imágenes de partículas revela el flujo a granel.
