Este protocolo de alto rendimiento permite el cribado rápido de plántulas de tomate de las adhesiones silvestres al patógeno bacteriano Pseudomonas syringae. El ensayo de inundación de plántulas minimiza el tiempo de crecimiento de la planta y las necesidades de la cámara de crecimiento, permite una rápida rotación de las plantas y permite probar grandes tamaños de muestra. Este ensayo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para detectar resistencia en adhesiones salvajes y otras líneas con antecedentes genéticos complejos.
El protocolo proporciona instrucciones específicas para la inoculación de inundación de dos cepas de Pseudomonas syringae. Sin embargo, es versátil y se puede modificar para detectar la resistencia del huésped a otros patógenos bacterianos. Demostrando el procedimiento estará Yana Hasan, especialista en investigación en mi laboratorio.
Comience por cultivar las plántulas de tomate. Coloque las semillas de tomate en un tubo de microcentrífuga de 2,2 mililitros y agregue dos mililitros de solución de lejía al 50%. Mece el tubo durante 25 minutos y retire la solución de lejía con una pipeta.
Añadir dos mililitros de agua ultra pura y lavar las semillas invirtiendo el tubo cinco veces. Aspirar el líquido del tubo y repetir el lavado cuatro veces más. Después del lavado final, añadir dos mililitros de agua ultrapura y verter las semillas en un plato estéril de Petri.
Esterilice los fórceps en llamas en etanol y luego utilícelos para transferir de cinco a siete semillas a una placa de 100 por 25 mililitros con 0,5 XMS más 0,8 por ciento de medios de agar. Selle los bordes de la placa con cinta quirúrgica. Asegúrese de que las placas estén apiladas planas y boca arriba.
Estratificar las semillas esterilizadas a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante al menos tres días para sincronizar la germinación. Después de tres días, orientar verticalmente las placas para que las raíces crezcan a lo largo de la superficie de la placa y la línea de semillas se oriente horizontalmente. Transfiera las semillas a una cámara de crecimiento establecida a 22 grados Celsius con un ciclo oscuro de 16 horas de luz y 8 horas.
Cultivar las plántulas durante diez días en la cámara, momento en el que normalmente se mostrarán completamente emergidos y expandidos cotiledones y saliendo primero hojas verdaderas. Raya las bacterias frescas sobre el agar KB apropiado con un palillo de dientes plano y estéril. Para PstT1, incubar la placa a 28 grados centígrados durante 48 horas antes de usar las bacterias en el experimento de inundación.
Para preparar el inóculo, reanimar asépticamente las bacterias en cloruro de magnesio estéril de diez mililitros a una densidad óptica de 0,1. A continuación, realice dos diluciones en serie para obtener una concentración de trabajo con un OD600 de 0075. También preparar una dilución de uno a diez de copolímero tensioactivo organosilicio no iónico en cloruro de magnesio de diez milimolares.
Vórtice y agréguelo a las bacterias, remondo el tubo para mezclar. Transfiera las placas con las plántulas de diez días de edad de la cámara de crecimiento al gabinete de bioseguridad y retire la cinta quirúrgica. A continuación, transfiera seis mililitros de inóculo a cada plato.
Empuje suavemente las plántulas en el inóculo con una punta de pipeta e inicie un temporizador durante tres minutos. Sostenga una placa en cada mano e incline la parte delantera de la placa hacia abajo para sumergir los cotiledones y las hojas de las plántulas. Swish el inóculo de lado a lado de cinco a siete veces, a continuación, inclinar las placas hacia atrás para cubrir las raíces con el inóculo.
Incline las placas de nuevo y repita el ciclo durante un total de tres minutos. Vierta el inóculo de las placas, colóquelos sobre una superficie plana y vierta cualquier inóculo residual por segunda vez. Vuelva a envolver las placas y colóquelas de nuevo en la cámara de crecimiento.
Los cultivares Moneymaker-PtoR y Moneymaker-PtoS se inundaron con PSTDC3000 y fenotipos de siete a diez días después de la inundación. Las plántulas Moneymaker-PtoR llevan el grupo genético PtoPRF y eran resistentes a la PSTDC3000. Mientras que las plántulas casi isógenas Moneymaker-PtoS, que no pueden reconocer los efectores PSTDC3000 AVRPto o AVRPto-B murieron rápidamente, dentro de los siete días después de la inundación.
Las plántulas de diez días de edad se inundaron con PstT1 y fenotiparon al menos diez días después de la inundación. Las adhesiones susceptibles estaban muertas, tenían meristems apicales marrones y carecían de un nuevo crecimiento. Por el contrario, las plántulas resistentes mostraron un alto nivel de nuevo crecimiento verde y sobrevivieron a la infección con PstT1.
Se llevaron a cabo ensayos de crecimiento bacteriano para confirmar cuantitativamente la resistencia a la PstT1 y Solanum NeoRici LA1329. Hubo una diferencia de registro de 1,7 en el crecimiento bacteriano entre LA1329 resistente y susceptible y una diferencia de registro de 1,6 entre la resistencia LA1329 y Moneymaker-PtoS, que se correlacionó con los resultados fenotípicos. Al realizar este ensayo, las cosas más importantes a recordar son prestar mucha atención a la técnica aséptica en todo el protocolo y asegurarse de que todas las plántulas en la placa están completamente inundadas.
Asegúrese de autoclave el tejido y las bacterias de las plantas infectadas y deseche los materiales de acuerdo con las regulaciones apropiadas.
