Este protocolo es significativo porque permite a los científicos realizar análisis genéticos sencillos de la enfermedad bacteriana de marchitamiento en el tomate. La principal ventaja de esta técnica es que la manipulación de la expresión génica y los ensayos posteriores se pueden realizar en poco tiempo y con los pequeños requisitos de equipos y espacio de crecimiento de la planta. Este método es muy versátil, y se puede aplicar a otras plantas de cultivo para realizar tanto la inoculación de patógenos y otros ensayos fisiológicos.
Para mantener la esterilidad durante la manipulación de plántulas in vitro, es importante mantener las placas cerradas cuando están fuera de la campana de flujo. Esta es una técnica fácil, pero requiere varios pasos para la manipulación. La visualización de este método ayudará a ver pequeños trucos que son difíciles de explicar en el manuscrito, ayudando a otros investigadores a implementar el método en sus laboratorios.
Ayudar a demostrar este procedimiento será Achen Zhao, un estudiante graduado. Después de esterilizar y lavar las semillas de tomate, transfiéralas a media fuerza Murashige y Skoog medio sin sacarosa. Mantenga las semillas en la oscuridad a una temperatura entre 25 y 28 grados Celsius durante tres días.
Coloque filtros autoclavedos de 8,5 centímetros cuadrados dentro de platos Petri de nueve centímetros cuadrados que contengan Murashige de media fuerza y medio Skoog, y coloque seis semillas de tomate germinadas en cada plato. Selle la placa con cinta de micropore e incubar las semillas germinadas a 25 a 28 grados centígrados durante tres o cuatro días. Cultivar el Agrobacterium rhizogenes MSU440 en medio LB sólido con antibióticos adecuados durante dos días a 28 grados Celsius antes de la transformación de la planta.
Usando un bisturí estéril, corta el radio y la parte inferior del hipocotilo de las plántulas de tomate. Utilice puntas de plástico o una cuchilla de bisturí para cosechar biomasa A.rhizogenes de la superficie del medio LB, y sumerja cuidadosamente las plántulas de tomate cortadas en la biomasa bacteriana. Después de esto, cubra las plántulas de tomate con un papel de filtro semicircular de dos centímetros por cuatro centímetros con el fin de mantener una alta humedad y facilitar la supervivencia y el desarrollo de nuevas raíces.
Es importante mantener las plántulas en alta humedad en un ambiente que permita la transpiración. Para ello, cubra las plántulas con papel de filtro y cierre la placa con cinta Micropore. Almacene las plántulas de tomate transformadas durante seis a siete días en una cámara de crecimiento a una temperatura de entre 25 y 28 grados centígrados.
Luego usa un bisturí estéril para cortar las nuevas raíces peludas emergentes, y deja que las plántulas produzcan nuevas raíces peludas. Una vez que aparezca la segunda generación de nuevas raíces peludas, retire el papel de filtro en la parte superior de las plántulas y selle la placa con cinta de microprés de nuevo. Para visualizar la fluorescencia DsRed o cualquier otro equipo para la toma de imágenes in vivo de la planta, marque las raíces transformadas positivas, que pueden ser identificadas por la fluorescencia roja.
Usa un bisturí para eliminar las raíces negativas no transformadas, que pueden ser identificadas por su falta de fluorescencia roja. Transfiera las plántulas que muestran fluorescencia roja a una nueva placa que contenga medio Murashige y Skoog de media resistencia para facilitar el desarrollo de la raíz transformada como raíz principal. Mantenga las plántulas que no muestran fluorescencia roja en la misma placa para comprobar la aparición de raíces fluorescentes en puntos de tiempo posteriores.
Cubra las plántulas con un papel de filtro semicírculo de dos centímetros por cuatro centímetros, selle la placa e incubar las plántulas para que desarrollen nuevas raíces peludas. Preparar las ollas de inoculación donde la superficie de las raíces se expondrá al inóculo bacteriano remojando primero las ollas de inoculación con agua, vertiendo cualquier exceso de agua, y luego colocándolas en una bandeja de siembra de plástico. Con pinzas, transfiera las plántulas seleccionadas con raíces transformadas a las macetas de inoculación.
Cubra la bandeja con una envoltura de plástico o una tapa transparente, y manténgala a 25 a 28 grados centígrados con 65% de humedad. Retire la cubierta después de cinco o seis días. Cultivar Ralstonia en cinco LB medio líquido en un agitador orbital a 28 grados Celsius, con temblor a 200 rpm, hasta la fase estacionaria.
Mida la densidad óptica a 600 nanómetros para determinar los números bacterianos. Diluir el cultivo bacteriano con agua a un OD600 de 1. Coloque de 16 a 20 ollas de inoculación que contengan plantas de tomate transformadas en una bandeja de inoculación.
A continuación, vierta 300 mililitros de inóculo bacteriano diluido en la bandeja, y deje que las plantas se empapen en el inóculo durante 20 minutos. Después de esto, preparar una nueva bandeja con una capa de tierra para macetas. Mueva las ollas inoculadas a la nueva bandeja y coloque las bandejas en una cámara de crecimiento con 75% de humedad, una temperatura entre 26 y 28 grados centígrados, y un fotoperiodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.
Aquí, las raíces de tomate se transforman e inoculan con Ralstonia para realizar análisis genéticos sencillos para el estudio de la enfermedad bacteriana. El desarrollo de los síntomas de la enfermedad se rastrea en plantas de tomate con raíces transformadas con un vector vacío y las transformadas con una construcción RAI dirigida al tomate CESA6. Los datos del índice de enfermedades se recopilan de la misma unidad experimental a lo largo del tiempo de acuerdo con una escala arbitraria de cero a cuatro y no siguen una distribución gaussiana, descartando el uso de pruebas estándar para datos paramétricos.
Como enfoque estándar, se utiliza una prueba U Mann-Whitney, de dos colas y no paramétrica para comparar las curvas de control e infección. Según este análisis, la diferencia entre las medianas de ambas curvas parece no ser significativa. También es posible cuantificar el área bajo la curva de progreso de la enfermedad, lo que permite combinar múltiples observaciones del progreso de la enfermedad en un solo valor.
El área bajo la curva de progreso de la enfermedad muestra un mayor valor para las plantas de control en comparación con las plantas de tomate CESA6 RNAi al final del proceso de infección, lo que indica que las plantas silenciadas por CESA6 de tomate son más resistentes a la infección por Ralstonia que las plantas de control. Los intervalos de confianza ofrecen una forma de estimar, con alta probabilidad, un rango de valores en el que se encuentra el valor poblacional de una variable determinada. Como se ve aquí, el área del intervalo de confianza del 95% para las curvas de control e infección estima una mayor probabilidad de resistencia cuando se silencia CESA6.
Los valores del índice de enfermedad se pueden transformar en datos binarios, teniendo en cuenta un índice de enfermedad inferior a dos correspondiente a cero y un índice de enfermedad igual o superior a dos correspondiente a uno. Esto permite la representación de una curva de supervivencia después de la inoculación de Ralstonia. Las diferencias en la tasa de supervivencia entre el control y las plantas infectadas no son estadísticamente significativas según la prueba estadística Gehan-Breslow-Wilcoxon.
La expresión de CESA6 se analiza en dos raíces transformadas seleccionadas aleatoriamente antes del paso de inoculación, mostrando que la resistencia mejorada a Ralstonia se correlaciona con la expresión reducida de CESA6. Después de dos rondas de selección, se puede obtener una tasa de transformación de 35 a 40%, y este valor se puede aumentar realizando rondas de selección adicionales. Al realizar este procedimiento, es importante mantener las plántulas cubiertas con un pedazo de papel de filtro para mantener una alta humedad y sellar las placas con Micropore para garantizar el intercambio de gas.
Después de la transformación de la raíz, muchos de los tratamientos se pueden aplicar para estudiar la respuesta vegetal mediante la observación de la fisiología de la raíz o utilizando biología molecular, biología celular, o bioquímica. Principalmente, esta técnica permitirá a los investigadores con recursos limitados realizar análisis genéticos de la infección bacteriana en las raíces de tomate.
