Questo lavoro è stato supportato dal budget principale del p53lab (BMSI, A*STAR) e dalla sovvenzione VIP JCO (A*STAR).

La linea cellulare HEK293 è stata utilizzata per il protocollo ed è stata coltivata nel Medium Aquila Modificata di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina e 100 U/mL penicillina/streptomicina. Le cellule sono state coltivate a 37 °C con il 5% di CO2 in un ambiente umidificato.
1. Valutazione quantitativa dell'interruzione complessa del FEI4F tramite il saggio di completamento eIF4E:eIF4G604-646
<ol><li>Coltura cellulare e transitoria transitoria del saggio di completamento eIF4E:eIF4G604-646<ol>
<li>Utilizzare cellule appena scongelate con meno di 20 passaggi per tutti gli esperimenti. Il primo giorno, determinare il numero di cella utilizzando un contatore di celle standard e contare le celle vitali totali utilizzando il metodo di esclusione blu Trypan13.</li>
		<li>Piastre seme 6-po 'con 0,9 - 1,2 x 106 di cellule HEK 293 per pozzo in 2 mL di mezzo di crescita standard. NOTA: Al fine di ottenere la migliore efficienza di trasfezione all'interno delle linee cellulari sopra indicate, assicurarsi che le cellule placcate siano confluenti al 70-90% il giorno dopo la semina.</li>
		<li>La mattina del secondo giorno, co-trasfezionare le cellule con subA-eIF4E ed eIF4G604-646-SubB plasmide utilizzando un reagente di trasfezione a base lipidica (vedi Tabella dei materiali)come descritto di seguito.<ol>
<li>Diluire 9 μL di soluzione a base di liposoma in un tubo contenente 125 μL di mezzo siero ridotto senza rosso fenolo (vedi Tabella dei materiali)per ogni trasfezione e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.</li>
			<li>Preparare la miscela master di DNA diluire 3 μg di ogni plasmide in 125 μL di mezzo siero ridotto per ogni tubo di trasfezione.</li>
			<li>Aggiungere 12 μL di reagenti enhancer al tubo mix master dna, mescolare bene e aggiungere immediatamente il DNA: enhancer master mix ad ogni tubo di liposomi diluiti in un rapporto 1:1. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
			<li>Aggiungere il complesso DNA-lipidico ad ogni pozzo e incubare le cellule in un incubatore di 37 °C con 5% di CO2 per 24 ore.</li>
		</ol>
</li>
		<li>La mattina del giorno 3, sciacquare ogni bene con 1 mL di PBS.</li>
		<li>Rimuovere il PBS e incubare le cellule in ogni pozzo con 0,3 mL di tripside per 5 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Neutralizzare la tripparina aggiungendo 2 ml del mezzo siero ridotto senza rosso fenolo contenente lo 0% di FCS in ogni pozzo e trasferire le cellule trasfette in un tubo da 15 ml. NOTA: Il rosso fenolo può interferire con l'attività della luciferasi; pertanto, le cellule devono essere maneggiate da questo passo in poi in mezzo senza rosso fenolo.</li>
		<li>Spin down celle per 5 min a 290 x g e aspirare il mezzo. Rimossare le cellule in 2 mL del mezzo siero ridotto senza rosso fenolo contenente lo 0% di FCS. Contare come descritto nel passaggio 1.1.</li>
		<li>I semi hanno trasfetto cellule HEK 293 in 96 piastre ben opache ad una densità di 30.000 cellule per pozzo in 90 μL di mezzo senza rosso fenolo contenente lo 0% di FCS. Al fine di ottenere 3 repliche tecniche all'interno dello stesso esperimento per 3 composti diversi, seme 60 pozzi delle piastre con cellule escluse i pozzi sui bordi.</li>
		<li>Subito dopo la semina delle cellule trasfette, aggiungere 10 μL di soluzione composta DMSO al 10% (vedere fase 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione composta<ol>
<li>Preparare soluzioni di stock composto da 1 mM sciogliendo il composto di interesse in DMSO al 100% (v/v). Per avere 3 repliche per ogni titolazione composta, utilizzare 8 μL della soluzione di stock composto da 1 mM. NOTA: Il volume di 1 mM di composto stock utilizzato è superiore a quello necessario. Questo viene fatto per tenere conto degli eventuali errori di pipettazione.</li>
		<li>Eseguire una diluizione seriale di 2 volte della soluzione di composto stock con 4 μL del materiale da 1 mM in 4 μL di DMSO al 100% per ogni punto di titolazione. NOTA: Per una titolazione composta completa, eseguire 9 diluizioni seriali dal materiale iniziale in DMSO al 100%. Se è necessario testare più composti, utilizzare una piastra di pozzo 96 e una pipetta multicanale per facilitare questo passaggio e le successive diluizioni.</li>
		<li>Aggiungere 36 μL di acqua sterile di grado HPLC per ogni punto della diluizione seriale 2 volte per preparare un 40 μL di soluzioni di lavoro 10x in DMSO al 10% (v/v) (cioè Da 100 μM a 0,39 μM 10% serie di scorte DMSO porterà a una soluzione finale da 10 μM a 0,039 μM, in 1% DMSO se aggiunto alle cellule). Per quanto riguarda il controllo del trattamento, preparare anche una soluzione stock solo DMSO al 10% in acqua sterile di grado HPLC.</li>
		<li>Aggiungere 10 μL di soluzioni di lavoro 10x alle celle della piastra ben opaca 96 al fine di ottenere la concentrazione finale prevista con una concentrazione residua di DMSO dell'1% (v/v) in un volume totale di 100 μL e incubare per 3 h a 37 °C con 5% v/v COatmosferica 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Test di complementazione luciferasi e fattibilità<ol>
<li>Dopo 3 ore di farmaco, iniziare a preparare il reagente del substrato di luciferasi combinando 1 volume di substrato con 19 volumi del reagente di diluizione (vedere le istruzioni del produttore). NOTA: Il saggio luciferasi viene eseguito utilizzando un kit disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere immediatamente 25 μL di reagente del substrato.</li>
		<li>Agitare la piastra a 350 giri/min per 50 minuti su uno shaker orbitale a temperatura ambiente.</li>
		<li>Valutare la luminescenza utilizzando un lettore di lastre. Per fare ciò, impostare il lettore di specchi sulla luminescenza e il filtro di emissione su 455. Utilizzare un'altezza di misura di 6,5 mm con un tempo di misurazione di 1 s.</li>
		<li>Per valutare la vitalità delle cellule, aggiungere 33 μL di reagente di dosaggio di vitalità e quindi rimescolare nuovamente la luminescenza dopo 15 minuti a temperatura ambiente, utilizzando il lettore di piastre.</li>
		<li>Valutare la luminescenza con il lettore di lastre impostando il lettore di specchi sulla luminescenza e il filtro di emissione su 600 nm. Utilizzare un'altezza di misura di 6,5 mm con un tempo di misurazione di 1 s. NOTA: La vitalità viene valutata misurando il livello intracellulare di ATP sullalisi cellulare secondo le istruzioni del produttore. Il multiplexing è possibile in questo caso poiché il saggio di fattibilità utilizza una luciferasi diversa con una diversa lunghezza d'onda di emissione.</li>
		<li>Utilizzate i dati per determinare i valori IC50 di ogni composto per curva adattando i dati a un'equazione della curva di raccordo a 4 parametri: Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D I valori numerici D e A devono essere vincolati nel processo di raccordo della curva: D = valore luminescente sull'asse Y per un asintoto di curva minimo o un livello teorico minimo di risposta previsto dal saggio di complementazione eIF4E:4G. A = valore luminescente sull'asse Y per l'asintoto della curva massima o la massima risposta teorica al livello prevista dal saggio di completamento eIF4E:4G. NOTA: Il valore per la risposta minima è derivato dal trattamento di controllo DMSO (v/v) dell'1% e il valore per la risposta massima deriva dalla risposta massima di un inibitore mTOR ad alta affinità che si è stabilizzato senza alcun effetto sulla vitalità cellulare.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Correlare l'inibizione del saggio eIF4E:eIF4G604-646 con interruzione complessa del fei4F nelle cellule
<ol><li>Confermare che il segnale misurato dal saggio corrisponde all'interruzione fisica dell'interazione eIF4E-eIF4G da parte del composto, cellule di semi come descritto al passaggio 1.1.</li>
	<li>Il giorno dopo, sostituire il mezzo con 1 mL di mezzo siero ridotto non contenente rosso fenolo e incubare per 4 ore con il composto di interesse. Assicurare una concentrazione residua di DMSO dell'1% (v/v) in un volume totale di 1 mL. NOTA: Per consentire facilmente una correlazione con il risultato, utilizzare concentrazioni composte all'inizio, al punto medio e all'estremità della curva di titolazione del saggio di complementazione misurata.</li>
	<li>Le celle Lyse ed eseguite m7GTP si abbassano per isolare i complessi eIF4F ed eIF4E:4EBP1. Procedure dettagliate su come eseguire l'esperimento pull down m7GTP possono essere trovate altrove14.</li>
	<li>Rilevare i livelli di proteine m7GTP bound eIF4G, eIF4E e 4EBP1 mediante analisi western blot, quindi correlare con l'interruzione del complesso eIF4F con l'inibizione del segnale di dosaggio di complementazione.</li>
</ol>

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo descritto in questo articolo utilizza un saggio di complementazione basato sulla luciferasi per monitorare quantitativamente l'assemblaggio complesso eIF4F attraverso la misurazione diretta dell'interazione eIF4G-eIF4E nelle cellule vive. Abbiamo fornito dettagli per l'uso del sistema di completamento eIF4E-eIF4G e abbiamo anche dimostrato che il sistema è estremamente accurato nella misurazione della dissociazione mediata da 4EBP1 indotta da farmaci dell'interazione eIF4E-eIF4G16. Al f...

Il controllo dell'espressione genica gioca un ruolo fondamentale nella corretta esecuzione di programmi cellulari come la proliferazione e la differenziazione della crescita. Un meccanismo di controllo normativo può essere esercitato sia a livello di trascrizione genica che a livello di traduzione dell'mRNA. Nell'ultimo decennio, è diventato sempre più evidente che il controllo traslazionale per modulazione del processo di iniziazione piuttosto che le fasi successive di allungamento e terminazione possono regolare finemente la sintesi di sottoinsiemi specifici di proteine che svolgono una vasta gamma di funzioni biologiche.
Una maggiore traduzione degli mRNA coinvolti nella sopravvivenza, nelle risposte anti-autofagiche e anti-apoptotiche è stata implicata in diversi tumori e sono state anche causalmente collegate all'attivazione aberrante o all'espressione sovraesperienza dei fattori di iniziazionealla traduzione 1.
Il complesso eIF4F è un regolatore principale dell'avvio della traduzione. Legando la struttura del limite alla fine dei 5' mRNA, eIF4F sta guidando il reclutamento iniziale di mRNA-ribosoma e, a sua volta, aumentando l'efficienza di traduzione dell'mRNA degli mRNA eucariotidebolmente tradotti 2. La traduzione mediata da eIF4F di mRNA correlati al cancro è stata segnalata per molti modelli di cancro che ospitano l'attivazione aberrante delle vie RAS/MAPK o AKT/TOR, suggerendo che le cellule tumorali upregolano eIF4F per aumentare la propria attività pro-neoplastica. L'interruzione di questo ciclo feed-forward inibendo la formazione complessa eIF4F è quindi una strategia terapeuticamolto promettente 3,4.
Il complesso eIF4F è costituito da (i) eIF4E, la subunità di legame con il tappo di eIF4F che interagisce con la struttura del cappuccio trovata al 5' UTR di mRNA, (ii) eIF4A, l'RNA elicase e (iii) eIF4G, la proteina dell'impalcatura che interagisce sia con eIF4A che con eIF4E e che alla fine recluta la subunità ribosomiale 40S5. L'associazione eIF4G con eIF4E è il passo limitante della velocità per l'assemblaggio di complessi eIF4F funzionali ed è regolata negativamente dalle proteine leganti eIF4E (4EMP, membri 1, 2 e 3))6. Competendo con l'associazione eIF4G a eIF4E attraverso un'interfaccia costituita da sequenze di associazione eIF4E canoniche e non canoniche7,8,9 (regione compresa tra aa 604-646 sull'eIF4E umano), 4EBP riduce il pool di eIF4E attivamente coinvolti nella traduzione e impedisce la formazione complessa eIF4F. L'interazione di queste interazioni proteina-proteina è regolata principalmente dal bersaglio dei mammiferi della fosforilazione mediata dalla rapamicina (mTOR) di 4EBP. Su stimoli mitogenici, mTOR fosforilati direttamente i membri della famiglia proteica 4E-BP, diminuendo la loro associazione con eIF4E e, quindi, promuovendo l'interazione eif4E-eIF4G e la formazione di complessi funzionali eIF4F10.
Nonostante il grande sforzo nello sviluppo di composti mirati all'integrità complessa di eIF4F, la mancanza di saggi che misurano l'interruzione diretta dell'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive ha limitato la ricerca di composti colpiti attivi cellulari. Abbiamo applicato un saggio di luciferasi basato su un analogo coelenterazina (ad esempio, test di complementazione basato su Nanoluc) per monitorare in tempo reale lo stato dell'integrità eIF4F attraverso l'interazione eIF4E-eIF4G. Il sistema proteico di complementazione della luciferasi è costituito da un frammento proteico da 18 kDa (SubA) e 11 frammenti di peptide amminoacido (SubB) ottimizzati per un'auto-associazione minimae stabilità 11. Una volta espresse come prodotto di fusione con l'eIF4E a figura intera umana e il dominio di interazione eIF4E di eiF4G1 umano (aa 604-646), le due proteine interagenti porteranno il frammento SubA e SubB in prossimità l'una dell'altra e indurranno la formazione della luciferasi attiva che, in presenza di un substrato permeabile cellulare, alla fine genererà un segnale luminoso luminescente (Figura 1). Abbiamo segnalato altrove la costruzione e la convalida del sistema di complemento eIF4E:eIF4G604-646 16.
Qui descriviamo come il sistema di complementazione eIF4E:eIF4G604-646 (disponibile su richiesta) può essere applicato per misurare con precisione l'interruzione eIF4E-eIF4G mediata da 4EBP1 nelle cellule vive. Inoltre, dimostriamo la sua utilità misurando gli effetti di diversi inibitori mTOR che sono attualmente in fase di sperimentazione clinica come potenziali farmaci terapeutici contro ilcancro 12. Poiché gli effetti off-target spesso mascherano l'attività specifica del farmaco, descriviamo anche come la versatilità della misurazione del sistema eIF4E:eIF4G604-646 può essere estesa con misurazioni ortogonali della vitalità cellulare per tenerne conto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

La formazione del complesso eIF4F ha dimostrato di essere il nodo chiave a valle per la convergenza delle vie di segnalazione che spesso subiscono l'attivazione oncogenica nell'uomo. eIF4F è un complesso di legame cap coinvolto nella fase di reclutamento mRNA-ribosoma dell'iniziazione alla traduzione. In molti modelli cellulari e precli clinici di tumori, la deregolamentazione dell'eIF4F porta a una maggiore traduzione di specifici sottoinsiemi di mRNA coinvolti nella proliferazione e nella sopravvivenza del cancro. eIF4F è un complesso etero-trimerico costruito dalla subunità eIF4E legante il tappo, dall'elisocca eIF4A e dalla subunità di impalcature eIF4G. Fondamentale per l'assemblaggio di complessi attivi eIF4F è l'interazione proteina-proteina tra proteine eIF4E ed eIF4G. In questo articolo viene descritto un protocollo per misurare l'assembly eIF4F che monitora lo stato dell'interazione eIF4E-eIF4G nelle celle vive. Il saggio di interazione proteina-proteina a base cellulare eIF4e:4G consente inoltre di valutare in modo accurato e affidabile i cambiamenti indotti dai farmaci nell'integrità complessa di eIF4F. Immaginiamo che questo metodo possa essere applicato per verificare l'attività dei composti disponibili in commercio o per un ulteriore screening di nuovi composti o modalità che interrompono in modo efficiente la formazione del complesso eIF4F.

Al fine di convalidare la sensibilità del sistema di complementazione eIF4E:eIF4G604-646, l'inibizione mediata 4EBP1 dell'assemblaggio complesso eIF4F è stata valutata utilizzando inibitori mTOR. Inibendo la fosforilazione dipendente dalla chinasi mTORC1 della famiglia di proteine 4EBP, l'inibizione mTOR migliora l'associazione 4EBP1 all'eIF4E e, quindi, allo smontaggio eIF4F15. Sono state testate due classi di inibitori meccanisticamente diversi delle...

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Qui presentiamo un protocollo per misurare l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive che consentirebbe all'utente di valutare la perturbazione indotta da farmaci delle dinamiche complesse eIF4F nei formati di screening.

Monitoraggio dell'assemblaggio eIF4F misurando l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K Views.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). Qui presentiamo un protocollo per misurare l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive che consentirebbe all'utente di valutare la perturbazione indotta da farmaci delle dinamiche complesse eIF4F nei formati di screening.

Video: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients have achieved complete remission (CR). Approximately half of the adult patients who entered CR will relapse within 12 months due to the outgrowth of residual AML cells in the bone marrow. The quantitation of these remaining leukemia cells, known as minimal or measurable residual disease (MRD), can be a robust biomarker for the prediction of these relapses. Moreover, retrospective analysis of several studies has shown that the presence of MRD in the bone marrow of AML patients correlates with poor survival. Not only is the total leukemic population, reflected by cells harboring a leukemia associated immune-phenotype (LAIP), associated with clinical outcome, but so is the immature low frequency subpopulation of leukemia stem cells (LSC), both of which can be monitored through flow cytometry MRD or MRD-like approaches. The availability of sensitive assays that enable detection of residual leukemia (stem) cells on the basis of disease-specific or disease-associated features (abnormal molecular markers or aberrant immunophenotypes) have drastically improved MRD assessment in AML. However, given the inherent heterogeneity and complexity of AML as a disease, methods for sampling bone marrow and performing MRD and LSC analysis should be harmonized when possible. In this manuscript we describe a detailed methodology for adequate bone marrow aspirate sampling, transport, sample processing for optimal multi-color flow cytometry assessment, and gating strategies to assess MRD and LSC to aid in therapeutic decision making for AML patients.

Detection of minimal or measurable residual disease (MRD) is an important prognostic biomarker for refining risk assessment and predicting relapse in acute myeloid leukemia (AML). These comprehensive guidelines and recommendations with best practices for consistent and accurate identification and detection of MRD, may aid in making effective AML treatment decisions.

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

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Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological information is also necessary. The protocol of immunocytochemical staining on paraffin-embedded cell blocks, presented herein, is an excellent alternative to immunofluorescent staining on non-paraffin-embedded fixed cells. In this protocol, a paraffin cell block from HeLa cells was prepared using the thromboplastin-plasma method, and immunocytochemistry was performed for the evaluation of two proliferation markers, CKAP2 and Ki-67. The nuclei and cytoplasmic morphology of the HeLa cells were well preserved in the cell-block slides. At the same time, the CKAP2 and Ki-67 staining patterns in the immunocytochemistry were quite similar to those in immunohistochemical staining in paraffin cancer tissues. With modified cell-culture conditions, including pre-incubation of HeLa cells under serum-free conditions, the effect could be evaluated while preserving architectural information. In conclusion, immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks is an excellent alternative to immunofluorescent staining.

Currently, immunofluorescent staining on fixed cells is the method of choice for determination of protein expression levels when morphological information is also necessary. This protocol presented herein provides for an alternative method of immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks.

Determinazione del livello di espressione della proteina in cellule coltivate di immunocitochimica su blocchi di paraffina celle

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as drug resistance, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and metastasis. Intratumoral eATP is 103 to 104 times higher in concentration than in normal tissues. While eATP functions as a messenger to activate purinergic signaling for EMT induction, it is also internalized by cancer cells through upregulated macropinocytosis, a specific type of endocytosis, to perform a wide variety of biological functions. These functions include providing energy to ATP-requiring biochemical reactions, donating phosphate groups during signal transduction, and facilitating or accelerating gene expression as a transcriptional cofactor. ATP is readily available, and its study in cancer and other fields will undoubtedly increase. However, eATP study remains at an early stage, and unresolved questions remain unanswered before the important and versatile activities played by eATP and internalized intracellular ATP can be fully unraveled.
These authors&#39; laboratories&#39; contributions to these early eATP studies include microscopic imaging of non-hydrolysable fluorescent ATP, coupled with high- and low-molecular weight fluorescent dextrans, which serve as macropinocytosis and endocytosis tracers, as well as various endocytosis inhibitors, to monitor and characterize the eATP internalization process. This imaging modality was applied to tumor cell lines and to immunodeficient mice, xenografted with human cancer tumors, to study eATP internalization in vitro and in vivo. This paper describes these in vitro and in vivo protocols, with an emphasis on modifying and finetuning assay conditions so that the macropinocytosis-/endocytosis-mediated eATP internalization assays can be successfully performed in different systems.

We developed a reproducible method to visualize the internalization of nonhydrolyzable fluorescent adenosine triphosphate (ATP), an ATP surrogate, with high cellular resolution. We validated our method using independent in vitro and in vivo assays-human tumor cell lines and immunodeficient mice xenografted with human tumor tissue.

Microscopia a fluorescenza per l'internalizzazione dell'ATP mediata dalla macropinocitosi in cellule tumorali umane e topi xenotrapiantati da tumore

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated molecular patterns and inducing the production of type I interferon. Immunotherapies, including checkpoint inhibition, primarily rely on preexisting tumor-specific T cells to unfold a therapeutic effect. Thus, synergistic therapeutic approaches that exploit immunogenic cell death as an intrinsic anti-cancer vaccine may improve their responsiveness. However, the spectrum of immunogenic factors released by cells under therapy-induced stress remains incompletely characterized, especially regarding extracellular vesicles (EVs). EVs, nano-scale membranous particles emitted from virtually all cells, are considered to facilitate intercellular communication and, in cancer, have been shown to mediate cross-priming against tumor antigens. To assess the immunogenic effect of EVs derived from tumors under various conditions, adaptable, scalable, and valid methods are sought-for. Therefore, herein a relatively easy and robust approach is presented to assess EVs' in vivo immunogenicity. The protocol is based on flow cytometry analysis of splenic T cells after in vivo immunization of mice with EVs, isolated by precipitation-based assays from tumor cell cultures under therapy or steady-state conditions. For example, this work shows that oxaliplatin exposure of B16-OVA murine melanoma cells resulted in the release of immunogenic EVs that can mediate the activation of tumor-reactive cytotoxic T cells. Hence, screening of EVs via in vivo immunization and flow cytometry identifies conditions under which immunogenic EVs can emerge. Identifying conditions of immunogenic EV release provides an essential prerequisite to testing EVs' therapeutic efficacy against cancer and exploring the underlying molecular mechanisms to ultimately unveil new insights into EVs' role in cancer immunology.

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

This manuscript describes how to assess in vivo immunogenicity of tumor cell-derived extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry. EVs derived from tumors undergoing treatment-induced immunogenic cell death seem particularly relevant in tumor immunosurveillance. This protocol exemplifies the assessment of oxaliplatin-induced immunostimulatory tumor EVs but can be adapted to various settings.

In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

Modellazione delle metastasi cerebrali mediante iniezione interna di cellule tumorali nell'arteria carotide

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...