Bu çalışma p53lab (BMSI, A*STAR) ve JCO VIP hibesinden (A*STAR) çekirdek bütçe ile desteklendi.

HEK293 hücre hattı protokol için kullanıldı ve Dulbecco'nun %10 Fetal Sığır Serumu, 2 mM L-glutamin ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş Modifiye Kartal Orta'sında kültürlendi. Hücreler nemlendirilmiş bir ortamda %5 CO2 ile 37 °C'de kültürlendi.
1. eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı test yoluyla eIF4F karmaşık bozulmanın nicel değerlendirmesi
<ol><li>Hücre kültürü ve eIF4E geçici transfeksiyon:eIF4G604-646 tamamlayıcı test<ol>
<li>Tüm deneyler için 20'den az pasajlı yeni çözülmüş hücreler kullanın. 1. günde, standart bir hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin ve Trypan mavi dışlama yöntemi13'ü kullanarak toplam uygulanabilir hücreleri sayın.</li>
		<li>2 mL standart büyüme ortamında kuyu başına 0,9 - 1,2 x 10 6 HEK 293 hücreli tohum6 kuyu plakaları. NOT: Yukarıda belirtilen hücre hatları içinde en iyi transfeksiyon verimliliğini elde etmek için, kaplamalı hücrelerin tohumlamadan sonraki gün% 70-90 birleştiğinden emin olun.</li>
		<li>2. günün sabahında, suba-eIF4E ve eIF4G604-646-SubB plazmid ile birlikte lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanarak hücrelerin eş transfectleri (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>9 μL lipozom bazlı çözeltiyi fenol kırmızısı olmadan 125 μL azaltılmış serum ortamı içeren bir tüpte seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu)her transfeksiyon için ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Her transfeksiyon tüpü için 125 μL azaltılmış serum ortamında her plazmidden 3 μg seyrelterek DNA'nın ana karışımını hazırlayın.</li>
			<li>DNA ana karışım tüpüne 12 μL arttırıcı reaktif ekleyin, iyice karıştırın ve hemen DNA'yı ekleyin: seyreltilmiş lipozomların her tüpüne 1:1 oranında arttırıcı ana karışımı. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır.</li>
			<li>DNA lipid kompleksini her kuyuya ekleyin ve hücreleri 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3. günün sabahında, her birini 1 mL PBS ile iyice durulayın.</li>
		<li>PBS'yi çıkarın ve her kuyudaki hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca 0,3 mL tripsin ile kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Her kuyuya % 0 FCS içeren fenol kırmızısı içermeyen azaltılmış serum ortamının 2 mL'sini ekleyerek trypsin'i nötralize edin ve transfected hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. NOT: Fenol kırmızısı luciferaz aktivitesini engelleyebilir; bu nedenle, hücreler bu adımdan itibaren fenol kırmızısı olmadan ortamda ele alınmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri 290 x g'da 5 dakika döndürün ve ortamı aspire edin. Hücreleri% 0 FCS içeren fenol kırmızısı olmadan azaltılmış serum ortamının 2 mL'sinde yeniden kullanın. Adım 1.1'de açıklandığı gibi sayın.</li>
		<li>Tohum, %0 FCS içeren fenol kırmızısı olmayan 90 μL orta alanda kuyu başına 30.000 hücre yoğunluğunda 96 kuyu opak plakada HEK 293 hücrelerini trans enfekte etti. 3 farklı bileşik için aynı deneyde 3 teknik çoğaltma elde etmek için, kenarlardaki kuyular hariç hücrelere sahip plakaların tohum 60 kuyusu.</li>
		<li>Transfected hücreleri tohumlamadan hemen sonra, % 10 DMSO bileşik çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin (bkz. adım 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik hazırlama<ol>
<li>Faiz bileşiği %100 DMSO 'da (v/v) eriterek 1 mM bileşik stok çözümleri hazırlayın. Her bileşik titrasyon için 3 çoğaltmaya sahip olmak için, 1 mM bileşik stok çözeltisinin 8 μL'sini kullanın. NOT: Kullanılan 1 mM stok bileşiği hacmi ihtiyaç duyulandan daha fazladır. Bu, varsa pipetleme hatalarını dikkate almak için yapılır.</li>
		<li>Stok bileşik çözeltisinin 2 kat seri seyreltilmesini, 1 mM'lik stoğun 4 μL'si ile her titrasyon noktası için % 100 DMSO'nun 4 μL'sine gerçekleştirin. NOT: Tam bir bileşik titrasyon için başlangıç stoğundan %100 DMSO'da 9 seri seyreltme gerçekleştirin. Birden fazla bileşiğin test edilmesi gerekiyorsa, bu adımı ve sonraki seyreltmeleri kolaylaştırmak için bir 96 kuyu plakası ve çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
		<li>%10 DMSO (v/v) (v/v) içinde 40 μL 10x çalışma çözümleri hazırlamak için 2 kat seri seyreltmenin her noktası için 36 μL HPLC sınıfı steril su ekleyin. 100 μM ila 0,39 μM %10 DMSO stok serisi, hücrelere eklendiğinde %1 DMSO'da 10 μM ila 0,039 μM arasında nihai bir çözüme yol açacaktır. Arıtma kontrolüne gelince, HPLC sınıfı steril suda% 10 DMSO sadece stok çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Toplam 100 μL hacimde% 1 (v / v) kalıntı DMSO konsantrasyonu ile hedeflenen son konsantrasyonu elde etmek için 96 kuyu opak plakasındaki hücrelere 10 μL 10x çalışma çözeltisi ekleyin ve% 5 v / v atmosferik CO2ile 37 ° C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Luciferaz kompleasyonu ve uygulanabilirlik tahlilleri<ol>
<li>3 saat ilaçlamadan sonra, 1 hacimli substratı seyreltme reaktifinin 19 hacmiyle birleştirerek luciferaz substrat reaktifini hazırlamaya başlayın (üreticinin talimatlarına bakın). NOT: Luciferaz tahlili, piyasada bulunan bir kit kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Hemen 25 μL substrat reaktif eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
		<li>Plakayı oda sıcaklığında yörüngesel bir çalkalayıcıda 50 dakika boyunca 350 rpm'de sallayın.</li>
		<li>Plaka okuyucu kullanarak lüminesansı değerlendirin. Bunu yapmak için ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 455'e ayarlayın. Ölçüm süresi 1 s olan 6,5 mm ölçüm yüksekliği kullanın.</li>
		<li>Hücre canlılığını yok etmek için, 33 μL canlılık tahlil reaktifi ekleyin ve plaka okuyucuyu kullanarak oda sıcaklığında 15 dakika sonra lüminesansı tekrar ölçün.</li>
		<li>Ayna okuyucuyu Lüminesans'a ve emisyon filtresini 600 nm'ye ayarlayarak plaka okuyucu ile lüminesansı değerlendirin. Ölçüm süresi 1 s olan 6,5 mm ölçüm yüksekliği kullanın. NOT: Uygulanabilirlik, üretici talimatlarına göre hücre içi ATP seviyesi hücre içi liziz üzerinde ölçülerek değerlendirilir. Bu durumda çoklama mümkündür, çünkü canlı test farklı bir emisyon dalga boyunda farklı bir luciferaz kullanır.</li>
		<li>Verileri 4 parametreli sığdırma eğrisi denklemine sığdırarak her bileşiğin IC50 değerlerini belirlemek için verileri kullanın: Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D D ve A sayısal değerleri eğri sığdırma işleminde kısıtlanmalıdır: D = eIF4E:4G tamamlama testinden beklenen minimum eğri asemptot veya minimum teorik yanıt seviyesi için Y eksenindeki parlak değer. A = eIF4E:4G tamamlama testinden beklenen maksimal eğri asemptot veya maksimal teorik seviye yanıtı için Y ekseninde parlaklık değeri. NOT: Minimum yanıtın değeri %1 DMSO (v/v) kontrol tedavisinden, maksimum yanıtın değeri ise hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan yüksek benzeşimli mTOR inhibitörünün maksimum tepkisinden elde edilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. eIF4E:eIF4G604-646 tahlil inhibisyonunu hücrelerde eIF4F karmaşık bozulması ile ilişkilendiren
<ol><li>Test tarafından ölçülen sinyalin, 1.1 adımında açıklandığı gibi, bileşik, tohum hücreleri tarafından eIF4E-eIF4G etkileşiminin fiziksel bozulmasına karşılık geldiğini onaylamak için.</li>
	<li>Ertesi gün, ortamı fenol kırmızısı içermeyen 1 mL azaltılmış serum ortamı ile değiştirin ve ilgi bileşiği ile 4 saat kuluçkaya yatırın. Toplam 1 mL hacimde %1 (v/v) kalıntı DMSO konsantrasyonu sağlayın. NOT: Sonuçla kolayca bir korelasyona izin vermek için, ölçülen tamamlayıcı test titrasyon eğrisinin başında, orta noktasında ve uç noktasında bileşik konsantrasyonlar kullanın.</li>
	<li>EIF4F ve eIF4E:4EBP1 komplekslerini izole etmek için Lyse hücreleri ve gerçekleştirilen m7GTP aşağı çekme. m7GTP aşağı çekme deneyinin nasıl gerçekleştirileceğine dair ayrıntılı prosedürler başka bir yerde bulunabilir14.</li>
	<li>Batı blot analizi ile m7GTP bağlı eIF4G, eIF4E ve 4EBP1 protein seviyelerini tespit edin ve ardından tamamlayıcı test sinyali inhibisyonu ile eIF4F karmaşık bozulması ile ilişkilidir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makalede açıklanan yöntem, canlı hücrelerde eIF4G-eIF4E etkileşiminin doğrudan ölçümü yoluyla eIF4F karmaşık montajını nicel olarak izlemek için luciferaz tabanlı bir tamamlayıcılık tahlili kullanır. EIF4E-eIF4G kompleasyon sisteminin kullanımı için ayrıntıları sağladık ve ayrıca sistemin eIF4E-eIF4G etkileşiminin ilaç kaynaklı 4EBP1 aracılı ayrışması ölçümlemede son derece doğru olduğunu gösterdik16. Bu tahlilin verimini kolaylaştırmak için, bu ma...

Gen ekspresyonunun kontrolü, büyüme çoğalması ve farklılaşma gibi hücresel programların doğru yürütülmesinde önemli bir rol oynar. Gen transkripsiyonu düzeyinde veya mRNA çevirisi düzeyinde bir düzenleyici kontrol mekanizması uygulanabilir. Son on yılda, daha sonraki uzama ve sonlandırma adımları yerine başlatma sürecinin modülasyonu ile çeviri kontrolünün, çok çeşitli biyolojik işlevleri oynayan belirli protein alt kümelerinin sentezini ince bir şekilde düzenleyebileceği giderek daha belirgin hale gelmiştir.
Sağkalım, anti-otofajik ve anti-apoptotik yanıtlarda yer alan mRNA'ların artan çevirisi birkaç kansere karışmıştır ve ayrıca sapkın aktivasyon veya çeviri başlatma faktörlerinin aşırı ekspresyonu ile nedensel olarak bağlantılıdır1.
eIF4F kompleksi, çeviri başlatmanın ana düzenleyicisidir. mRNA'ların 5' ucundaki kapak yapısını bağlayarak, eIF4F ilk mRNA-ribozom alımını yönlendiriyor ve buna karşılık zayıf çevrilmiş ökaryotikmRNA'larınmRNA çeviri verimliliğini artırıyor 2 . Kansere bağlı mRNA'ların eIF4F aracılı çevirisi, RAS / MAPK veya AKT / TOR yollarının anormal aktivasyonunu barındıran birçok kanser modeli için bildirilmiştir, bu da kanser hücrelerinin kendi neoplastik aktivitelerini artırmak için eIF4F'yi yükselttiğini göstermektedir. EIF4F karmaşık oluşumunu engelleyerek bu ilerleme döngüsünün bozulması, böylece çok umut verici bir terapötik stratejidir3,4.
eIF4F kompleksi (i) eIF4E, mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase ve (iii) eIF4G'nin 5' UTR'sinde bulunan kapak yapısıyla etkileşime giren eIF4F'nin kapak bağlama alt birliği, hem eIF4A hem de eIF4E ile etkileşime giren ve sonunda 40S ribozomal alt birliği5'iişe alan iskele proteini. eIF4E ile eIF4G ilişkisi fonksiyonel eIF4F komplekslerinin montajı için hız sınırlayıcı adımdır ve eIF4E bağlayıcı proteinler (4EBP'ler, üyeler 1, 2 ve 3)) tarafından olumsuz düzenlenir6. 4EBP, kurallı ve kurallı olmayan eIF4E bağlama dizileri7, 8,9'dan (insan eIF4E'de aa 604-646'yı kapsayan bölge) oluşan bir arayüz aracılığıyla eIF4E'ye eIF4G bağlama ile rekabet ederek, çeviride aktif olarak yer alan eIF4E havuzunu azaltır ve eIF4F karmaşık oluşumunu önler. Bu protein-protein etkileşimlerinin etkileşimi esas olarak 4EBP'nin rapamycin (mTOR) aracılı fosforilasyonunun memeli hedefi tarafından düzenlenir. Mitojenik uyaranlar üzerine, mTOR doğrudan 4E-BP protein ailesinin üyelerini fosforilize eder, eIF4E ile ilişkilerini azaltır ve böylece eIF4E-eIF4G etkileşimini ve fonksiyonel eIF4F komplekslerinin oluşumunu teşvikeder 10.
EIF4F karmaşık bütünlüğünü hedefleyen bileşikler geliştirmedeki büyük çabaya rağmen, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin doğrudan bozulmasını ölçen tahlillerin olmaması hücresel aktif isabet bileşiklerinin aranmasını sınırlamıştır. EIF4E-eIF4G etkileşimi yoluyla eIF4F bütünlüğünün durumunu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir koelenterazin analoga (örneğin, Nanolüc tabanlı kompleasyon tahlili) dayanan bir luciferaz tahlil uyguladık. Luciferaz kompleasyon protein sistemi, minimum kendi kendine ilişki ve stabilite için optimize edilmiş 18 kDa protein parçası (SubA) ve 11 amino asit peptit parçasından (SubB) oluşur11. Bir kez insan tam uzunlukta eIF4E ve insan eiF4G1 (aa 604-646) eIF4E etkileşim etki alanı ile bir füzyon ürünü olarak ifade edildikten sonra, iki etkileşim proteini SubA ve SubB parçasını birbirlerinin yakınına getirecek ve aktif luciferaz oluşumunu teşvik edecektir, bir hücre geçirgen substratı varlığında, sonunda parlak bir parlaklık sinyali üretecektir (Şekil 1). EIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin16.
Burada, canlı hücrelerde 4EBP1 aracılı eIF4E-eIF4G bozulmasını doğru bir şekilde ölçmek için eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı sisteminin (istek üzerine kullanılabilir) nasıl uygulanabileceğini açıklıyoruz. Ek olarak, şu anda klinik çalışmalar altında olan birkaç mTOR inhibitörünün etkilerini potansiyel kanser terapötik ilaçlar olarak ölçerek faydasını gösteriyoruz12. Hedef dışı etkiler genellikle ilaca özgü aktiviteyi maskelediğinden, eIF4E:eIF4G604-646 sistem ölçümünün çok yönlülüğünün, bunları dikkate almak için hücresel canlılığın ortogonal ölçümleriyle nasıl genişletilebileceğini de açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

eIF4F kompleksinin oluşumu, insanlarda sıklıkla onkojenik aktivasyona uğrayan sinyal yollarının yakınsaması için anahtar aşağı akış düğümü olarak gösterilmiştir. eIF4F, çeviri başlatmanın mRNA-ribozom işe alım aşamasında yer alan bir kapak bağlama kompleksidir. Birçok hücresel ve klinik öncesi kanser modelinde, eIF4F'nin deregülasyonu, kanserin çoğalması ve sağkalımında rol oynayan spesifik mRNA alt kümelerinin çevirisinin artmasına yol açar. eIF4F, kapak bağlama alt birliği eIF4E, helicase eIF4A ve iskele alt birliği eIF4G'den inşa edilmiş hetero-trimerik bir komplekstir. Aktif eIF4F komplekslerinin montajı için kritik olan eIF4E ve eIF4G proteinleri arasındaki protein-protein etkileşimidir. Bu makalede, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin durumunu izleyen eIF4F derlemesini ölçmek için bir protokol açıklıyoruz. eIF4e:4G hücre bazlı protein-protein etkileşimi tahlili, eIF4F karmaşık bütünlüğündeki ilaç kaynaklı değişikliklerin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini de sağlar. Bu yöntemin ticari olarak mevcut bileşiklerin aktivitesini doğrulamak veya eIF4F kompleksinin oluşumunu verimli bir şekilde bozan yeni bileşiklerin veya modalitelerin daha fazla taranması için uygulanabileceğini öngörüyoruz.

eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin hassasiyetini doğrulamak için mTOR inhibitörleri kullanılarak eIF4F kompleks montajının 4EBP1 aracılı inhibisyonu değerlendirildi. 4EBP protein ailesinin mTORC1 kinaz bağımlı fosforilasyonunu inhibe ederek, mTOR inhibisyonu eIF4E'ye 4EBP1 ilişkisini geliştirir ve bu nedenle eIF4F sökme15. MTOR kinazlarının mekanistik olarak farklı inhibitörünün iki sınıfı test edilmiştir: mTORC1'in allost...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K Görüntüleme.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Video: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients have achieved complete remission (CR). Approximately half of the adult patients who entered CR will relapse within 12 months due to the outgrowth of residual AML cells in the bone marrow. The quantitation of these remaining leukemia cells, known as minimal or measurable residual disease (MRD), can be a robust biomarker for the prediction of these relapses. Moreover, retrospective analysis of several studies has shown that the presence of MRD in the bone marrow of AML patients correlates with poor survival. Not only is the total leukemic population, reflected by cells harboring a leukemia associated immune-phenotype (LAIP), associated with clinical outcome, but so is the immature low frequency subpopulation of leukemia stem cells (LSC), both of which can be monitored through flow cytometry MRD or MRD-like approaches. The availability of sensitive assays that enable detection of residual leukemia (stem) cells on the basis of disease-specific or disease-associated features (abnormal molecular markers or aberrant immunophenotypes) have drastically improved MRD assessment in AML. However, given the inherent heterogeneity and complexity of AML as a disease, methods for sampling bone marrow and performing MRD and LSC analysis should be harmonized when possible. In this manuscript we describe a detailed methodology for adequate bone marrow aspirate sampling, transport, sample processing for optimal multi-color flow cytometry assessment, and gating strategies to assess MRD and LSC to aid in therapeutic decision making for AML patients.

Detection of minimal or measurable residual disease (MRD) is an important prognostic biomarker for refining risk assessment and predicting relapse in acute myeloid leukemia (AML). These comprehensive guidelines and recommendations with best practices for consistent and accurate identification and detection of MRD, may aid in making effective AML treatment decisions.

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Kanser Araştırmaları

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological information is also necessary. The protocol of immunocytochemical staining on paraffin-embedded cell blocks, presented herein, is an excellent alternative to immunofluorescent staining on non-paraffin-embedded fixed cells. In this protocol, a paraffin cell block from HeLa cells was prepared using the thromboplastin-plasma method, and immunocytochemistry was performed for the evaluation of two proliferation markers, CKAP2 and Ki-67. The nuclei and cytoplasmic morphology of the HeLa cells were well preserved in the cell-block slides. At the same time, the CKAP2 and Ki-67 staining patterns in the immunocytochemistry were quite similar to those in immunohistochemical staining in paraffin cancer tissues. With modified cell-culture conditions, including pre-incubation of HeLa cells under serum-free conditions, the effect could be evaluated while preserving architectural information. In conclusion, immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks is an excellent alternative to immunofluorescent staining.

Currently, immunofluorescent staining on fixed cells is the method of choice for determination of protein expression levels when morphological information is also necessary. This protocol presented herein provides for an alternative method of immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks.

Immunocytochemistry hücre parafin gömülü bloklar tarafından kültürlü hücrelerdeki Protein ifade düzeyinin belirlenmesi

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Hepatosellüler Karsinomdaki Tümör-Stromal Etkileşimi Araştırmak İçin Üç Boyutlu Sferoid Modeli

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

Kanser Hücrelerinin İç Karotis Arter Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

Toplu ve Tek-Organoid Analizi için Geniş Alan Canlı Hücre Görüntüleme Kullanılarak Multiparametrik Tümör Organoid İlaç Taraması

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D tumoroids. Since patient derived tumor organoids can retain the characteristics of the original tumor, these reliable preclinical models enable cancer drug screening and the study of drug resistance mechanisms. However, CRC related death in patients is mostly associated with the presence of metastatic disease. It is therefore essential to evaluate the efficacy of anti-cancer therapies in relevant in vivo models that truly recapitulate the key molecular features of human cancer metastasis. We have established an orthotopic model based on the injection of CRC patient-derived cancer cells directly into the cecum wall of mice. These tumor cells develop primary tumors in the cecum that metastasize to the liver and lungs, which is frequently observed in patients with advanced CRC. This CRC mouse model can be used to evaluate drug responses monitored by microcomputed tomography (&#181;CT), a clinically relevant small-scale imaging method that can easily identify primary tumors or metastases in patients. Here, we describe the surgical procedure and the required methodology to implant patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice.

This protocol describes the orthotopic implantation of patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice. The model recapitulates advanced colorectal cancer metastatic disease and allows for the evaluation of new therapeutic drugs in a clinically relevant scenario of lung and liver metastases.

Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...