Este trabajo fue apoyado por becas de la Wellcome Trust y BBSRC a IG. IG es un Wellcome Senior Fellow.

1. Generación y El pase de Líneas Celulares SILAC marcado Nota: el uso de tripsina-EDTA se debe evitar en todas las etapas de pases y la preparación de las muestras experimentales para el análisis como la tripsina puede contener aminoácidos sin etiqueta, lo que llevaría al etiquetado incompleto de muestras. <ol><li> Para preparar una botella de medios SILAC añadir una alícuota de una arginina marcada de manera apropiada-SILAC (84 mg / ml en PBS) y lisina (146 mg / ml en PBS) a una botella de 500 ml de Arg / Lys DMEM libre (que contiene 0,5 ml L-glutamina). </li><li> A continuación, añadir 50 ml de FBS dializado y 5 ml de penicilina / estreptomicina a la botella de 500 ml. Nota: Las celdas HEK 293T (ATCC) deben mantenerse en medio DMEM que carecen de arginina y lisina y se completará con la luz (R0K0), media (R6K4) o fuerte (R10K8) aminoácidos, suero bovino fetal dializado (10 kDa de corte), y la penicilina / estreptomicina. Las células deben ser mantenidos en los medios de comunicación durante un mínimo de 5 divisiones celulares para asegurar una completaetiquetado. En la mayoría de los casos las células se marcan con facilidad en ≥ 2 semanas. </li><li> Para dividir celdas para pases, las células deben ser desalojados de la monocapa golpeando el frasco. Las alternativas incluyen el uso de raspadores de células o mediante el uso de tampón de disociación celular basada en PBS libre de enzimas. Nota: Para conservar los medios de comunicación, las células deben ser pasados ​​en matraces T25 y el número de células más grandes generan sólo inmediatamente antes de un experimento. </li><li> 24 horas antes de la transfección de las células, semillas de 3,5 x 10 6 células SILAC marcado en un único plato de 10 cm 2 para cada condición experimental bajo investigación. </li></ol> 2. La transfección de células marcadas con construcciones pEGFP-fusión <ol><li> Retire el papel de las células y reemplazarlo con 9 ml de antibiótico libre SILAC DMEM (Luz, medio o pesado). Nota: Los antibióticos no deben añadirse a los medios de comunicación ya que pueden interferir con la eficacia de los reactivos de transfección basadas en liposomas. </li><li> Prepare una mezcla de 10 g de plásmido apropiado (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-I, pEGFP-eIF4A-II) en 500 l de antibiótico-libre SILAC DMEM y se mezcla con 500 l de DMEM SILAC libre de antibióticos que contienen 10 l de reactivo de transfección (por ejemplo, lipofectamina 2000). Mezcle la reacción a fondo con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. </li><li> Incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 20 min y a continuación añadir gota a gota a la monocapa de células. Rock the placa suavemente de lado a lado. </li><li> Se incuban las células transfectadas a 37 ° C y 10% de CO 2 durante 24 horas. Nota: Si la expresión de una proteína de resultados de interés en cualquier toxicidad aparente, entonces puede ser necesario reducir la cantidad de plásmido transfectado y / o la duración del período de expresión posterior. </li></ol> 3. Lisados ​​celulares de cosecha <ol><li> Las células de la cosecha del plato en helada PBS utilizando un rascador de células. Recoger las células por centrifugación a 220 xg, 476; C durante 5 min. Lavar las células una 3x más en 10 ml de PBS enfriado en hielo. </li><li> Resuspender el sedimento de células en 200 l de tampón de lisis celular (10 mM de TrisCl / pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, 0,5% de NP40) que contiene recién añadido cóctel inhibidor de la proteasa III a una concentración de 1x y cóctel de RNasa (opcional) en 5 l por ml. Nota: Para las proteínas con ácido nucleico conocida la actividad de unión, puede ser necesario añadir nucleasas al lisado antes de la precipitación. En los casos en donde se añade nucleasa, las muestras se deben incubar en hielo durante 30 min en hielo, con pipeteando cada 10 min. La extracción de ácido nucleico total de una pequeña fracción de la muestra y el análisis por electroforesis en gel de agarosa puede probar la eficacia de la nucleasa. </li><li> Centrifugar las muestras a 13.000 xg, 4 ° C durante 10 min retienen el sobrenadante como el lisado celular soluble. </li><li> La concentración del lisado celular debe ser evaluada por ensayo BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li>Utilizar una solución tampón de lisis que contenía cóctel inhibidor de la proteasa III para normalizar la concentración de proteína en un volumen final de 500 l. </li><li> Ajustar el volumen a 1 ml con la adición de 500 l de tampón de dilución (10 mM de TrisCl / pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM) que contenía cóctel inhibidor de la proteasa III a una concentración de 1x final. Una alícuota de 50 l de la muestra debe conservarse como la entrada de la muestra y el lisado se mantuvo en hielo mientras que la preparación perlas anti-GFP (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias-trampa). Nota: Por lo general los rendimientos varían entre 1 a 3,5 mg de proteína en la final de 1 ml de muestra. Mientras que los tampones anteriores son adecuados para muchas proteínas de interés, para otros puede ser necesario modificar los componentes del tampón para asegurar el cebo de proteína se solubiliza y mantener interacciones proteína-proteína. Alteraciones posibles incluyen el agente tampón (fosfato, HEPES), concentración de sal (150-500 mM), la elección del detergente, u otros aditivos. </li></ol> 4. La unión a anti-GCuentas de PF <ol><li> Brevemente vórtex con la suspensión de perlas para resuspender las perlas. Con una punta de pipeta de 200 l con el extremo cortado, transferir 25 l de los granos por muestra a un tubo nuevo. Nota: El usuario debe preparar las cuentas para un solo experimento SILAC como una mezcla maestra para minimizar la variación de muestra a muestra. </li><li> Por cada 25 l de suspensión de perlas, añadir 20 volúmenes (1.500 l por 75 l purines) de tampón de dilución, y centrifugar las cuentas a 2.700 xg durante 5 min. A continuación, lavar las perlas de un 2x más en 20 volúmenes de tampón de dilución. </li><li> Añadir 100 l de tampón de dilución por cada 25 l de talón suspensión. Utilizando una punta de 200 l con el extremo cortado, transferir 85 l de esta suspensión se resuspendieron a cada una de las muestras de SILAC marcado de paso 3.6. </li><li> Incubar las muestras con las cuentas de un rotador a 4 º C durante 2 horas. </li></ol> 5. Lavar, elución, y preparación de muestras para análisis MS <ol><li> Centrifugar las muestras a 2700 xg, 46; C durante 5 min. 50 l del sobrenadante deben ser retenidos como la muestra no unida, con el resto del sobrenadante descartado. </li><li> Tampón de dilución de 1 ml, debe añadirse a cada tubo para resuspender las perlas y la muestra se centrifugó a 2700 xg, 4 ° C durante 5 min. El sobrenadante se debe desechar. Esto se debe realizar dos veces. </li><li> Eluir la proteína de las perlas por la adición de 50 l de tampón de carga 2x SDS, y calentamiento a 95 ° C durante 10 min. Se precipitan las perlas mediante centrifugación a 2700 xg durante 2 min a 4 ° C </li><li> Conservar el sobrenadante en tubos prelubricados, donde puede ser después se almacenó a -80 ° C hasta que sea necesario. Para el envío a un centro de la espectrometría de masa, mezclar muestras etiquetadas 01:01:01 (por ejemplo, 10 l de cada uno) y presentar la muestra mixta. Nota: En este punto, las muestras pueden ser probadas por Western blot, tinción de plata o de otros medios de prueba para la interacción con los compañeros de unión conocidos / desconocidos. Un ejemplo se da en la figuraUre 2 que muestra la unión específica de un socio conocido interacción - eIF4G por Western blot, y la aparición de bandas de tinción de plata presentes en las muestras desplegables de una proteína de interés, pero no una muestra de control. </li><li> Someter la muestra para el análisis LC-MS/MS. Nota: una vez satisfecho de que una proteína de la etiqueta de interés se vincula con éxito los compañeros de interacción, volúmenes iguales de cada muestra marcada (ligero, medio y pesado) son combinados y presentados para su análisis LC-MS/MS. Es habitual que presente 30 l total de una muestra de IP para el análisis. Esto implicaría la mezcla 10 l de muestra de luz marcada con 10 l de muestras marcado pesados ​​marcado con medianas y 10 l para dar un total de 30 l. </li></ol> 6 Análisis de Datos I:. Interpretación de los resultados, y la eliminación de Identificaciones de baja confianza Nota: Una lista de los títulos de las columnas devueltas por el software proteoma Descubridor se da en la Tabla 1 Dif.rentes software (por ejemplo, MSQuant, MaxQuant) volverá a partidas distintas, sin embargo, sólo un subconjunto de ellos son necesarios para el análisis y éstos son comunes a los diferentes paquetes de software. Los datos siempre deben incluir un número de acceso para cada proteína identificada, la relación de la comparación de cada relación de la muestra (luz vs media, ligera vs pesados, medianos vs etc pesado), el número único de péptidos identificados, y algún tipo de tasa de falsos positivos o indicación confianza. <ol><li> Antes de ir a través de los datos, en primer lugar, copie los datos en bruto a una nueva hoja de cálculo. A partir de esta hoja de cálculo de eliminar todas las columnas salvo los que den el número de acceso, número único de péptidos, los ratios que comparan muestras, relación de la variabilidad y la descripción de proteínas. Si se realizaron réplicas de los experimentos, estos deben ser combinados en un solo archivo de Excel, con cada experimento que aparece en una ficha independiente. Nota: los datos de confianza baja incluye proteínas identificadas por un solo péptido único, y los waquí cuantificación no era posible. </li><li> Utilice la función &#39;sort&#39; Sobresale &#39;para ordenar los datos por el número de péptidos y eliminar las entradas para las proteínas que carecen de más de un péptido. Luego, ordenar por relación y eliminar las proteínas que carecen de relaciones SILAC (proteínas no cuantificados). </li><li> Convertir proporciones SILAC en un registro de 2 valores utilizando la fórmula: &#39;= log (ratio de SILAC, 2)&#39;, donde se sustituye «Ratio SILAC &#39;para el identificador de celda. Nota: como una relación de SILAC resultados en los datos para las proteínas que muestran una disminución en la abundancia está restringida a valores entre 0 y 1, que es habitual para convertir una relación de SILAC a una relación de SILAC registro 2, ya que esto significa proteínas tanto aumentado o disminuido en una muestra están representados en una escala logarítmica, donde 2 o -2 representa un aumento de 4 veces o disminución de la abundancia, y 3 o -3 un aumento de 9 veces o disminución de la abundancia, respectivamente. A raíz de esta transformación, los datos deben ajustarse a una Gadistribución usia centrado alrededor de una relación de SILAC registro 2 de 0. Un ejemplo de esto se da en la Figura 3. </li><li> Crear nuevas columnas en el archivo de Excel y calcular log 2 ratios SILAC para todas las muestras / columnas simuladas. Para la conversión de una relación fingida / muestra a una relación muestra / maqueta, utilice la fórmula: &quot;= 1/ratio&quot; </li></ol> 7 Análisis de Datos II:. Selección de interacciones de alta confianza de estudio adicional <ol><li> Abrir Graphpad Prism, seleccione Nuevo&gt; Tabla de datos y gráfico ... Select &#39;columna&#39; de la lista en el lado izquierdo de la ventana y seleccione el botón ENTER / Importar datos&gt; Introduzca los valores de réplica, apilados en columnas opciones. Presione &#39;Crear&#39;. </li><li> Seleccione y copie una columna determinada proporción de 2 log de ​​la muestra / Mock SILAC de la hoja de cálculo de Excel en el nuevo archivo de Prism. </li><li> Haga clic en el menú desplegable &quot;Insertar&quot; y seleccione &quot;Nuevo análisis&quot;. Conforme al análisis de la columna, seleccione &#39;Distribución de frecuencias. Mantener las opciones por defecto, haga clic en &#39;Aceptar&#39;. Nota: Este paso genera un histograma que ilustra el número de proteínas identificadas en una relación dada. Esto debería formar una distribución gaussiana. </li><li> En la carpeta de &quot;Resultados&quot; se habrá generado una nueva sección &quot;Histograma&quot;. Seleccione la sección de distribución de frecuencias. </li><li> Haga clic en el menú desplegable &quot;Insertar&quot; y seleccione Nuevo análisis&gt; XY&gt; Regresión no lineal (ajuste de la curva). Haga clic en &#39;distribución de Gauss&#39; y haga clic en Aceptar. Nota: Este paso se ajusta a una curva a los datos de distribución de frecuencia generados en la etapa 7.3, los valores que pueden utilizarse posteriormente para calcular los umbrales de significación rendimiento. </li><li> En la ventana de resultados que aparece, se dan la media y la desviación estándar. Generar un umbral mediante la adición de 1,96 desviaciones estándar de la media. Nota: Estos valores representan la media y la desviación estándar de la dist Gaussribution, no el conjunto de datos total. 1.96 desviaciones estándar colocarían un umbral en el límite de confianza del 95% (p ≤ 0,05). 2.58 SD daría el 99%, y el 3,3 SD 99,9%. El umbral debe determinarse individualmente para cada réplica experimento, ya que puede variar. </li></ol> 8 Análisis de Datos III. Fusión de los conjuntos de datos de réplica Nota: Para tener confianza en la identificación de socios de la interacción de una típica desplegable experimento SILAC idealmente se debe realizar tres veces, con el medio y muestras etiquetadas pesados ​​conmutada por una de las repeticiones de controlar para cualquier efecto de los medios de comunicación de los resultados. Una proteína que se muestra como la interacción en al menos dos de los tres experimentos, con la &#39;muestra switched&#39;-medios de comunicación ideal que representa uno de estos, es una interacción de alta confianza. <ol><li> Volver al archivo de Excel, cree una nueva pestaña llamada &#39;Combinado&#39;. Columna Etiqueta A &#39;adhesión&#39; y copiar todos los números de la adhesión de cada uno of los experimentos individuales en esta sola columna. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;Datos&quot;, y luego la opción &quot;Eliminar Duplicados. </li><li> Crear columnas para las relaciones de SILAC, y la relación de la variabilidad de cada experimento, así como para la columna Nombre / Descripción de la proteína. </li><li> En la ficha Descripción, utilice la fórmula BUSCARV para recoger la descripción de cada número de entrada. Arrastre la fórmula hacia abajo la columna para anotar la descripción de proteínas. La fórmula BUSCARV es: &quot;= BUSCARV (AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, False)&quot;, donde: AccessionNo es $ aX siendo X el número de fila WheretoLook es la &#39;pestaña Experiment Name&#39; $ A $ 2:.! $ Y $ Z donde Y y Z son la pieza inferior derecha de los datos en la hoja de cálculo que se hace referencia. ColumnsAccross es el número de columnas a través del número de la adhesiónbre en la columna A un valor deseado miente. Nota: Por ejemplo, si el número de acceso se encuentra en la columna A, y los datos de interés se encuentra en la columna E. El valor aquí sería 5 (columna A cuenta como 1). Como los números de acceso se agruparon en el paso b, es más probable que vlookup no obtendrá todos los nombres requeridos a partir de un experimento. Cuando regresa N / A, modifique la fórmula para obtener la descripción de cada experimento, a su vez hasta que se adquieran todas las descripciones. </li><li> Para resaltar las proteínas que interactúan en la combinación de datos, seleccione cada columna relación individual y haga clic en la ficha Inicio, seguido de reglas células Formato condicional&gt; Resaltar&gt; Más reglas. </li><li> Seleccione el estilo &#39;Classic&#39;. Formato únicas células que contienen &#39;Valor de la celda&#39;, &#39;Mayor que o igual a &quot;. En el cuadro, escriba el valor de la desviación estándar de 1,96, y haga clic en &#39;Aceptar&#39;. </li><li> Evaluar la variabilidad ratio para cada interacción positiva. Si restando la var%ESPONSABILIDAD caería un &#39;hit&#39; por debajo del valor umbral, este debe ser tratado con precaución. Nota: Esto representa la consistencia de las relaciones individuales de cada péptido que componen relación SILAC &#39;unas proteínas son, y se da como un porcentaje. Cuando se toma la variabilidad relación en cuenta y una proteína da una relación de SILAC por encima del umbral, esta proteína representa un éxito. Si la variabilidad relación da un rango que está por debajo del umbral, el &#39;hit&#39; puede representar un contaminante. </li><li> Repita esto para cada una de las columnas de resultados y compararlos a través de experimentos. Proteínas destacadas identificadas en dos o más experimentos representan una interacción de alta confianza. Nota: En función de la base de datos utilizada para asignar los números de acceso de proteínas, en diferentes experimentos una proteína puede haber sido identificada en una diferente, o incluso múltiples números de acceso. Es importante verificar esto para asegurarse de que las proteínas no se incluyeron, accidentalmente. </li&gt; </ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La estrategia desplegable SILAC descrito aquí representa un medio muy sensibles y de gran alcance de la detección de la proteína novedosa: las interacciones de proteínas, y además permite la discriminación rápida y simple de los patrones alterados de unión entre las muestras estrechamente relacionados de interés. En este ejemplo se utilizó esta técnica para investigar la proteína: proteína interacciones de las proteínas eIF4AI y eIF4AII 6. Para el conocimiento del autor, este es el primer estudio en la literatura explotar la utilidad de la proteómica SILAC para investigar el interactome celular de estas dos isoformas de eIF4A. El enfoque descrito anteriormente utiliza un GFP-etiqueta y anti-GFP bolas 9, 10 y, por tanto, las modificaciones pueden ser necesarias para que este enfoque que se utilizará para una proteína específica de interés, por ejemplo, si la etiqueta se coloca en el extremo N-o C-terminal de una proteína. Siempre que sea posible, transferencias Western o ensayos funcionales deberíanllevar a cabo para detectar la unión de una pareja de interacción proteína conocida. En caso de una proteína no tolerar la fusión con una etiqueta de las buenas prácticas agrarias, otra de marcado o estrategias desplegables se han aplicado a jalones SILAC utilizando tanto otras etiquetas (FLAG 11, biotina 12, PEIF (datos propios, sin publicar)), o mediante el uso de anticuerpos primarios contra una proteína de interés en la que siRNA desmontables de la proteína diana ofrece una muestra de control 13. Tales experimentos se han descrito en otra parte en la literatura, pero en breve, paso 1 y pasos 5.4-8 se aplica como anteriormente, con los pasos 2-5.3 modificados según sea apropiado para el sistema de expresión / desplegable de selección utilizando las entradas iguales de proteína como se describe en pasos 2.4 a 2.5. Dado que el grado de cuantificación permiten proteínas de unión no específica a ser retirados en el nivel de análisis, se recomienda omitir la pre-incubación con cuentas de control, o lavados elevadas de sal con el fin de preservar las proteínas de baja afinidad: interacciones de proteínas con una proteína de interés . Una ma nucleasay pueden incluir u omitir de este protocolo de acuerdo con las características específicas de una experiencia particular. Por ejemplo: como las proteínas utilizadas en este método son helicasas de ARN, RNasa cóctel se incluyó en el protocolo para eliminar interacciones indirectas mediadas a través de la ARN (paso 3.2). En algunos casos, sin embargo, podría haber un beneficio de llevar a cabo experimentos paralelos con y sin nucleasa para identificar las interacciones dependientes de ácidos nucleicos. Dentro de este protocolo, se recomienda el cambio de muestras &#39;pesados&#39; en replicar experimentos &quot;medio&quot; y para controlar la variación introducida por las diferencias en los medios de comunicación SILAC o el crecimiento celular. Un control alternativo incluye la modificación secuencial de los tres (&quot;light&quot;, &quot;medio&quot; y &quot;pesado&quot;) los medios de comunicación en la réplica de experimentos. Mientras que este enfoque es potencialmente más estrictas, sí aumenta la complejidad del análisis, como en al menos una repetición, una proteína de interés Wenfermo se produce en las células &quot;light&quot; etiquetados y por lo que es necesario distinguir entre las proteínas identificadas consistentemente en las muestras de &quot;light&quot; (contaminantes ambientales, tales como las queratinas), y los que sólo se enriquecen en las muestras &quot;light&quot; cuando se une a una proteína de interés. Aunque el uso de datos de cuantificación permite la discriminación de-específica de las interacciones no específicas mediante el uso de un umbral, inevitablemente algunas interacciones genuinas puede ser desechada. El enfoque anterior es un método sencillo y rápido para la identificación de proteínas: proteína interacciones que pueden ser fácilmente intentaron por investigadores sin experiencia previa con la espectrometría de masas, o el análisis de grandes conjuntos de datos de proteínas: proteína interacción. Para la mayoría de usos esto es más que suficiente para la identificación de nuevas proteínas de interés. Otras modificaciones a este enfoque para ayudar a reducir esta pérdida de datos se describen en la literatura y en otros lugares incluyen el uso de un PRbiblioteca frecuencia Otein donde conoce proteínas contaminantes para un conjunto específico de parámetros experimentales (línea celular, matriz de grano, las condiciones de tampón) puede ser excluido 10, 14. Sin embargo, dependiendo de los parámetros experimentales particulares puede ser necesario para realizar un número de experimentos de control para generar un proteoma de talón y por lo tanto esto puede aumentar tanto el gasto y la complejidad del experimento. Para más información sobre esta técnica se encuentra disponible en el sitio web www.peptracker.co.uk 14. También debe tenerse en cuenta que el protocolo descrito anteriormente consiste en mezclar muestras marcadas de manera diferente en el final del proceso de inmunoprecipitación (denominado una mezcla después de la purificación - MAPA SILAC experimento). Esto se hace en forma de proteínas: proteína interacciones se producen en un equilibrio determinado 15. Debe tenerse en cuenta que otros grupos han combinado este enfoque SILAC MAPA se describe en este protocolo con la incubación de las muestrasantes de la desplegable (purificación después de la mezcla - PAM SILAC) para diferentes periodos de tiempo (20 min a 2 horas se han utilizado en la literatura) 15, 16. Sobre la base de la rapidez con gotas de una relación de proteína a 01:01, es posible investigar cualitativamente afinidades de unión y para definir las proteínas como las proteínas que interactúan estables o dinámicos 15. En resumen, jalones SILAC representan un medio muy poderoso para identificar las proteínas que interactúan con una determinada proteína de interés, en un ambiente fisiológicamente relevante. La técnica se puede adaptar muy fácilmente a un número de diferentes estrategias de purificación, lo que permite su aplicación a cualquier proteína dada de interés. La cuantificación de los resultados simplifica enormemente la identificación de interacciones auténticos, y permite la relajación de las condiciones de tampón estrictas utilizadas para eliminar los aglutinantes no específicos, y por lo tanto preserva las interacciones de baja afinidad. Como hasta tres muestras se pueden comparar en lo anteriorestrategia, la técnica tiene ventajas claras en comparación de las diferencias en la proteína de unión entre las diferentes isoformas de proteínas, las proteínas mutantes, o el efecto de los inhibidores farmacológicos. A medida que se analizaron cortes de gel enteras en lugar de las bandas individuales que mancha por Coomassie, el número de proteínas identificadas en el alto grado de confianza suelen ser mayores que las señaladas en el GST / TAP-menú desplegable estándar y experimentador sesgo en la selección de proteínas de interés se quita. Por tanto, la técnica se compara muy favorablemente con otras técnicas utilizadas comúnmente utilizados en la identificación de nuevas proteínas-las interacciones (levadura de 2 híbridos, GST / His o TAP Pulldowns).

Un paso esencial en la comprensión de la función de proteínas es la identificación de las proteínas que interactúan pertinentes. Cuando tales proteínas son desconocidos hay una serie de técnicas disponibles, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Estos incluyen el sistema de levadura de dos híbridos, menú desplegable ensayos que utilizan proteínas recombinantes, así como la purificación por afinidad en tándem o TAP-etiquetado 1, 2. Una adición más reciente a estas técnicas es la combinación de la purificación por afinidad de una proteína de interés a partir de una línea celular de mamífero relevante, seguido de espectrometría de masas cuantitativa utilizando el etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) 3. Esto tiene ventajas sobre el enfoque de la levadura de dos híbridos en que la localización celular y modificaciones post-traduccionales no son perturbados, así como las ventajas más tradicional de TAP-de marcado en la que se trata de un enfoque cuantitativo en lugar de cualitativo que permite al usuario REAdily distinguir de forma no específica las proteínas que interactúan y contaminantes, de los factores del huésped que se unen específicamente. Además, como una muestra normalmente se analizó su conjunto, en lugar de las bandas de proteínas como individuales, proteínas de interés no están enmascaradas por la migración de manera similar las proteínas en un gel, ni tampoco suelen necesitar estar presentes en niveles suficientes para ser visibles después de la tinción, lo que lleva a aumento del número de proteínas identificadas con confianza 4. Para demostrar esta técnica, GFP fusiones del factor de iniciación de la traducción eucariótica estrechamente relacionado eIF4AI y eIF4AII que comparten más de una identidad de aminoácidos del 90% fueron investigados por SILAC-inmunoprecipitación proteómica cuantitativa. EIF4AI humano y II fueron clonados dentro de pEGFP-C1 para formar una proteína de fusión de GFP donde se fusiona con el extremo N-terminal de eIF4A. Para evitar la necesidad de generar líneas celulares estables de transfección transitoria se utilizó para entregar estas construcciones a células 293T de isótopos estables etiquetados. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Las células se marcaron primero durante dos semanas en SILAC medios de cultivo celular, seguido de la transfección del plásmido de ADN que codifica una proteína de interés. Las células se lisaron a continuación, la concentración de proteína normalizaron, y cantidades iguales de afinidad de lisado purificaron en agarosa anti-GFP. Igual cantidad de eluido se combinaron después y se sometieron a análisis LC-MS/MS. Los resultados de este análisis se procesan entonces para identificar proteínas de alta confianza: las interacciones proteína (Figura 1). Inmunoprecipitación SILAC permite identificar no sólo las interacciones directas, sino también de baja afinidad o interacciones indirectas con complejos de proteínas 4. Usando este sistema, eIF4AI y II inmunoprecipitaciones permitió la identificación reproducible y seguro de la pareja principal de unión eIF4G (isoformas I / II y III) 5, así como las interacciones indirectas con eIF4E, y numerosos componentes del complejo eIF3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium &#160;(DMEM)</td>
			<td style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td style="width:88px;">LM010</td>
			<td style="width:745px;">DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:271px;">Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml</td>
			<td rowspan="2" style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">DS1003</td>
			<td rowspan="2" style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Arginine (R0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">A8094</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R6) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CLM-2265</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R10) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-539</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lysine (K0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L8662</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K4) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">DLM-2640</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K8) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-291</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml</td>
			<td style="width:87px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">15140-122</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:88px;">11668-027</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">GFP-trap Agarose (500&#956;l resin)</td>
			<td style="width:87px;">Chromotek</td>
			<td style="width:88px;">gta-20</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">5x SDS Sample loading buffer</td>
			<td style="width:87px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">PN39000</td>
			<td style="width:745px;">The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:88px;">539134</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1.7ml&#160; prelubricated tubes</td>
			<td style="width:87px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3207</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BCA protein assay kit (1L)</td>
			<td style="width:87px;">Pierce</td>
			<td style="width:88px;">23225</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tris (Trizma)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Rnase cocktail</td>
			<td style="width:87px;">Ambion</td>
			<td>AM2286&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">NP-40 alternative</td>
			<td style="width:87px;">Millipore</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein interaction partners in mammalian cells using silac-immunoprecipitation quantitative proteomics

Proteómica cuantitativa, junto con la purificación de inmunoafinidad, inmunoprecipitación SILAC, representan un poderoso medio para el descubrimiento de la nueva proteína: proteína interacciones. Al permitir la cuantificación relativa precisa de la abundancia de proteínas tanto en el control y las muestras de ensayo, verdaderos interacciones pueden distinguirse fácilmente de los contaminantes experimentales. Interacciones de baja afinidad se pueden preservar mediante el uso de condiciones de tampón menos estrictos y siguen siendo fácilmente identificable. Este protocolo describe el etiquetado de las células de cultivo de tejidos con isótopos estables etiquetados aminoácidos, la transfección y la inmunoprecipitación de una afinidad etiquetado proteína de interés, seguido de la preparación para la presentación a una instalación de espectrometría de masas. Este protocolo a continuación explica cómo analizar e interpretar los datos devueltos por el espectrómetro de masas con el fin de identificar a los socios celulares que interactúan con una proteína de interés. A modo de ejemplo se aplica esta técnica para identificar proteínas de unión a los factores de iniciación de la traducción eucarióticos: eIF4AI y eIF4AII.

En un experimento típico de pulldown SILAC, la gran mayoría de las proteínas identificadas (&gt; 90%) representan los contaminantes, así como proteínas de unión no específica a la matriz de afinidad y esto se ilustra en la figura 2B, aun cuando los protocolos de lavado eliminan la mayoría de los contaminantes citoplasmáticos tales como GAPDH (Figura 2A). Sin embargo, el agrupamiento de la unión no específica de proteínas en una distribución normal permite que las proteínas que se unen específicamente a una proteína de interés para ser distinguidos como estos tienen mayores proporciones de muestra / simulacros de que el fondo. Mientras que los contaminantes deben agruparse teóricamente en torno a una relación de SILAC registro 2 de 0, esto no es necesariamente el caso, un ejemplo de esto se da en la Figura 3. Las posibles razones para esto incluyen el etiquetado de SILAC imperfecta de las células, la carga de volúmenes o concentraciones de lisado desiguales en las perlas anti-GFP, la pérdida accidental de los granos durante la purificación o la mezcla desigualción de las muestras al final del procedimiento de purificación 3. Sin embargo, suponiendo que los datos se analizaron sobre la base de una desviación estándar de umbral de la media de los contaminantes normalmente distribuidos, cambios menores en el centrado de los datos no deben afectar a la calidad de los resultados. Al comparar las diferencias en las interacciones de proteína entre dos proteínas relacionadas, puede producirse una situación similar en el que una proteína de interés se produce a niveles más altos dentro de las células de un segundo (ya sea debido a la variación en la eficiencia de transfección, o una propiedad intrínseca de la proteína o ARNm) . Algunos variación en la expresión (por ejemplo, la Figura 2A) pueden ser corregidos por el análisis de la relación de SILAC para estas dos muestras. En este ejemplo, estos serían los ejemplos de buenas prácticas agrarias-eIF4AI y GFP-eIF4AII. Mediante el análisis de la relación 4AI/4AII SILAC como se discutió en la sección 7, es posible identificar las proteínas cuya unión varía significativamente entre las isoformas. <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; En la figura 4, una representación de las proteínas de unión a eIF4A-identificados en uno de los experimentos llevados a cabo réplicas se muestra que ilustra la cobertura del complejo de factor de iniciación de este protocolo logra. Las proporciones más altas se observaron típicamente con eIF4G, que se une directamente a eIF4A, con relaciones más bajas para eIF4E, que se une a eIF4G en un sitio lejos del sitio de unión eIF4A-. Se observaron índices más bajos para los miembros del complejo eIF3. Sin embargo, esto ilustra claramente que el experimento identificado satisfactoriamente parejas de unión tanto directos como indirectos de eIF4AI y II. Como se podría esperar a partir de su alta identidad de secuencia 6, las interacciones proteína: proteína aparecieron muy conservada entre las dos isoformas en este sistema experimental 7, 8. Una selección de algunas de las proteínas que interactúan se dan en la Tabla 2, que ilustra el formato de datos. <table border="0" cellpadding="0" cellsporrida = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Encabezado de columna </td><td> Descripción </td></tr><tr><td> Adhesión </td><td> Muestra el número de acceso para la secuencia </td></tr><tr><td> Cobertura </td><td> Proporción de la secuencia de la proteína cubierto por los péptidos identificados </td></tr><tr><td> ♯ PSM </td><td> Péptido partido espectral </td></tr><tr><td> ♯ péptidos </td><td> Número total de péptidos únicos identificados para una proteína </td></tr><tr><td> ♯ AA </td><td> La longitud de una proteína en aminoácidos </td></tr><tr><td> MW (Da) </td><td> El peso molecular de una proteína en Daltons. Excluye modificaciones </td></tr><tr><td> calc. PI </td><td> El punto isoeléctrico teórico de una proteína </td></tr><tr><td> Puntuación </td><td> La puntuación total de una proteína (que representa la suma de la Indivlas puntuaciones de péptidos iDual). La puntuación exacta requerida para la significación varía entre los experimentos. Una instalación de MS suele aplicar un corte falso descubrimiento tasa del 5%. </td></tr><tr><td> Secuencia </td><td> La secuencia de aminoácidos que constituyen la proteína </td></tr><tr><td> Proporción </td><td> La intensidad relativa de los péptidos en una muestra marcada con nombre, en comparación con una segunda muestra marcada </td></tr><tr><td> Count Ratio </td><td> El número de relaciones de péptidos que se utilizaron para calcular la relación de una proteína dada </td></tr><tr><td> Variabilidad Ratio (%) </td><td> La variabilidad de los ratios de péptidos individuales que se utilizan para calcular una relación de proteína dada </td></tr><tr><td> Descripción </td><td> El nombre de la proteína </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Encabezados de columna estándar de un informe proteoma de Discoverer.Mientras que la información útil se puede obtener de todas estas columnas, los críticos de este análisis se muestran en negrita. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057"><tbody><tr><td> Adhesión </td><td> Péptidos </td><td> 4AI/Mock </td><td> 4AII/Mock </td><td> Nombre </td><td> Análisis SILAC </td></tr><tr><td> A8K7F6 </td><td> 21 </td><td> 100 </td><td> 1 </td><td> eIF4AI </td><td rowspan="2"> Proteína &#39;Bait&#39; </td></tr><tr><td> Q14240 </td><td> 22 </td><td> 0.01 </td><td> 90.855 </td><td> eIF4AII </td></tr><tr><td> G5E9S1 </td><td> 25 </td><td> 47.575 </td><td> 30.53 </td><td> eIF4GI </td><td rowspan="3"> Interactuando proteínas </td></tr><tr><td> Q59GJ0 </td><td> 5 </td><td> 11.778 </td><td> 10.619 </td><td> eIF4GII60; </td></tr><tr><td> P06730 </td><td> 3 </td><td> 7.22 </td><td> 7.57 </td><td> eIF4E </td></tr><tr><td> Q5T6W5 </td><td> 4 </td><td> 0.685 </td><td> 0.646 </td><td> hnRNPK </td><td rowspan="2"> Contaminantes no específicamente de unión </td></tr><tr><td> P62805 </td><td> 1 </td><td> 0.531 </td><td> 0.498 </td><td> La histona H4 </td></tr><tr><td> H6VRG2 </td><td> 18 </td><td> - </td><td> - </td><td> Queratina-1 </td><td rowspan="2"> Los contaminantes ambientales </td></tr><tr><td> P35527 </td><td> 11 </td><td> 0.01 </td><td> 0.01 </td><td> Queratina-1 citoesqueleto 9 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Datos típicos de un experimento de inmunoprecipitación SILAC. Dando datos de ejemplo para una proteína de interés / cebo (altas péptidos, alto cociente), proteínas que interactúan con una proteína de interés (péptidos de alta / baja, alta relación), no específicamente de unión proteínas (alto-bajo Pept /ides, la relación cae por debajo de corte - en este experimento 0.96), y los contaminantes ambientales (a menudo péptidos altos, relación negativa / por debajo del umbral). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1.jpg" /> Figura 1. Plan experimental. En primer lugar las células se cultivan en medios que carecen de arginina y lisina y sustituidos con isótopos estables marcado con arginina y lisina durante 2 semanas (1). (2) Las células se sembraron en 10 cm 2 platos y transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican GFP (Mock) o proteínas de fusión de GFP (muestras). (3) Las células se lisan y las proteínas GFP o de fusión GFP se inmunoprecipitaron a partir de lisados ​​celulares. (4) Las muestras se combinan en una proporción de 1:1 y se sometieron a análisis de LC-MS/MS. Luego se analiza los datos para eliminar bajo ident proteína confianzacaciones y para seleccionar un nivel de enriquecimiento de proteína correspondiente a las proteínas que interactúan genuinos. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2.jpg" /> Figura 2. Confirmación de las condiciones de inmunoprecipitación adecuados. A) Análisis de transferencia de Western de lisados ​​de células, así como las fracciones no unidas y unidas de la inmunoprecipitación confirma la expresión y la inmunoprecipitación de la proteína de interés. Un western blot contra GAPDH confirma el agotamiento de proteínas no interaccionan y un western blot, además, una interacción socio conocido de eIF4A confirma la inmunoprecipitación con éxito de las proteínas de unión a la proteína de interés. B) Cuando no se sabe que interactúan los socios de una proteína de interés, un gel teñido con plata puede confirmar inmunoprecipitación de las proteínas que interactúan. En esta plata-mancha<html> bandas de gel ed para GFP y GFP-eIF4AI/II son claras, y una banda que migraba a la talla correcta para eIF4G está presente sólo en los carriles GFP-4AI/II-bound y no en el carril de control GFP. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3.jpg" /> Figura 3. Los resultados representativos. Histograma que muestra la distribución de las proporciones de proteínas a partir de una repetición de (A) GFP-eIF4AI o (B)-GFP eIF4AII desplegable. El punto de corte 1,96 desviación estándar se marca con una línea discontinua. Proteínas que interactúan caen fuera de los contaminantes normalmente distribuidas-son evidentes a partir de ~ 0,25 y 1 en (A), y ~ 0,3-1,5 en (B). les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Identificación de los miembros del complejo eIF desde una sola réplica de un experimento SILAC IP. Proteínas en verde fueron la proteína de interés utilizada para el pulldown Interactuando proteínas están sombreadas de rojo a blanco, según la relación de log 2 SILAC en el IP SILAC con rojo siendo la proteína más abundante en el análisis, y siendo el blanco el corte 1,96 SD. Proteínas sombreadas en gris no se identificaron en este análisis.

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Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Experimentos de inmunoprecipitación SILAC representan un poderoso medio para descubrir nueva proteína: proteína interacciones. Al permitir la cuantificación relativa precisa de la abundancia de proteínas tanto en el control y las muestras de ensayo, verdaderos interacciones se puede distinguir fácilmente de los contaminantes experimentales, y las interacciones de baja afinidad conservada a través del uso de condiciones de tampón menos estrictos.

Identificación de proteínas compañeros de interacción en células de mamífero utilizando SILAC-inmunoprecipitación cuantitativos Proteómica

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

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Research

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Biology

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Investigación

Biología

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genoma toda la Proteína-proteína interacción Screening por Complementación de ensayo de proteínas-fragmento (PCA) en las células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...