Los modelos de trasplante son herramientas valiosas para la investigación inmunológica que a menudo requieren experiencia quirúrgica. Aquí, presentamos un enfoque factible para el trasplante heterotópico de células musculares cardíacas y del corazón en ratas. Al resaltar y simplificar todos los pasos cruciales de nuestro modelo, los investigadores sin antecedentes quirúrgicos deben ser capaces de dominar este modelo en una cantidad razonable de tiempo.
Ambos modelos de trasplante proporcionan información valiosa sobre los mecanismos de tolerancia y rechazo y se pueden aplicar en varias especies. Tenemos mucha experiencia en la enseñanza de este modelo a individuos sin formación quirúrgica previa. Después de aprender los pasos cruciales, aconsejamos paciencia y suficiente práctica con animales fallecidos.
Para la explantación cardíaca del donante, después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal en animales anestesizados de siete a 22 semanas de edad, aplique lubricante para los ojos y use cortadoras mecánicas para eliminar el pelaje abdominal y torácico. Coloque la rata en la posición supina sobre una base de calentamiento y fije las extremidades en la base de la mesa de operaciones con bandas elásticas. Desinfectar la piel expuesta con 70% de etanol y realizar una laparotomía mediana.
Inserte los retractores en la incisión y utilice hisopos de algodón esterilizados para movilizar el intestino al lado izquierdo del donante para exponer la vena cava inferior. A continuación, perforar la vena cava inferior para permitir la inyección intravenosa de 500 unidades internacionales de heparina disueltas en un mililitro de solución salina isotónica helada. Detenga el sangrado en el sitio perforado después de la retracción de la aguja por compresión ligera usando un hisopo de algodón.
Incite el diafragma, realice una toracotomía lateral a ambos lados del donante y ancle la pared del tórax. Retire el pericardio y el nervio vagal mediante una preparación contundente utilizando dos soportes de micro-aguja. Para la exsanguinación, transectar los vasos abdominales e insertar la rama contundente de una sonda apuntando tijeras en el seno pericárdico transversal.
Usa una compresa para diseccionar la aorta ascendente y la arteria pulmonar de la forma más distal posible bajo la ligera tracción caudal del corazón. Coloque una sola ligadura 5-0 alrededor de la vena cava superior e inferior y las venas pulmonares y apriete la ligadura escalonadamente de la forma dorsal posible. Cortar el tejido dorsal a la ligadura y extraer el corazón.
Para perfunder el corazón explantado, utilice una cánula de calibre 18 de un catéter intravenoso para lavar 30 mililitros de solución salina isotónica helada complementada con 1000 unidades internacionales de heparina a través de la aorta ascendente y la arteria pulmonar antes de colocar el corazón en un tubo de 15 mililitros de solución salina sobre hielo. Después de preparar la rata receptora de 10 a 14 semanas, como acaba de demostrar, movilice los intestinos al lado superior izquierdo del receptor en una compresa caliente y húmeda. Y ajustar el microscopio quirúrgico o una alternativa suficiente.
Después de movilizar el duodeno y el jejuno proximal, respectivamente, usando un aumento completo de cinco a siete, utilice hisopos de algodón y disección contundente para exponer la aorta abdominal y la vena cava inferior. Usando dos soportes de agujas micro para elevar los vasos abdominales sin dañar las venas lumbares, coloque una abrazadera vascular Cooley en los vasos. Utilice una cánula de calibre 27 arqueada de 30 a 45 grados para perforar los vasos abdominales.
Y utilice tijeras Potts para agrandar el sitio de punción en una incisión longitudinal que coincida con el tamaño del lumen de los vasos donantes. Para eliminar los coágulos y prevenir la trombosis postoperatoria, perfunda los vasos con solución salina y coloque el injerto en los lugares. Usando dos simples interrumpidos 8-0 monofilamento de suturas no reabsorbibles, fijar la aorta ascendente del donante a la aorta abdominal receptora en las esquinas craneales y caudales de la incisión longitudinal.
Para anastomose la aorta ascendente del donante con la aorta abdominal del receptor colocar el injerto a la derecha de los vasos receptores mientras se realiza la primera mitad de la anastomosis con una carrera 8-0 sutura monofilamento. A continuación, coloque el injerto a la izquierda de los vasos receptores y realice la segunda mitad de la anastomosis. Fijar la arteria pulmonar del donante a la vena cava inferior de una manera similar con dos nudos de esquina en las esquinas craneales y caudales.
Después de fijar el recipiente donante con nudos en cada esquina, coloque una puntada desde el exterior hasta el interior del vaso para ejecutar una anastomosis intraluminal para la primera mitad de la anastomosis. Antes de atando la sutura, coloque otra puntada desde el interior hasta el exterior. Para prevenir la embolia periférica después de terminar la segunda mitad de la anastomosis, enjuague la anastomosis con solución salina antes de apretar el nudo de la segunda mitad de la anastomosis.
Coloque una gasa hemostática alrededor de ambas anstomosas y suelte cuidadosamente la abrazadera vascular Cooley para permitir la reperfusión del injerto. Manejo de cualquier sangrado con compresión ligera y hisopos de algodón esterilizados. Después de unos 60 segundos, el corazón debe comenzar a latir.
Sustituya cuidadosamente los intestinos y cierre la fascia abdominal y la piel con suturas de polifilamento continuos separados de 3-0. En el momento experimental apropiado, cosecha un corazón de rata donante como se demostró y usa un bisturí estéril o tijeras estériles para triturar el corazón en fragmentos de tres por tres milímetros. Digerir las piezas en 20 mililitros de medio de cultivo complementados con 0,5 miligramos por mililitro de colagenasa durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
Al final de la digestión, agrega el tejido a un tamiz de poro grande, mientras eliminas el medio de cultivo. Añadir de cinco a 10 mililitros de solución salina isotónica y colar la suspensión del tejido a través del tamiz. Y después de centrifugar la suspensión celular dos veces, filtrarla a través de un colador celular de 40 micrómetros.
Enjuague el colador con cinco a 10 mililitros de solución salina isotónica para recoger las células restantes. Y después de la centrifugación, resuspender las células cardíacas de rata aisladas en solución salina a una concentración de cinco veces 10 a las quintas células por mililitro. Cargue una jeringa de un mililitros con la solución celular y coloque el animal receptor anestesiado en una posición lateral con el oído objetivo hacia arriba.
Fije la oreja con un dedo y cinta adhesiva de doble cara, y utilice una cánula de calibre 27 para inyectar por vía subcutánea 20 microlitros de solución de células musculares cardíacas cerca de los vasos capilares visuales en el oído del receptor. Después del período de observación experimental adecuado, extraiga los ganglios linfáticos cervicales drenantes y realice los análisis posteriores adecuados de interés. Los trasplantes singénicos sobrevivieron hasta 100 días sin signos de fallo del injerto.
La combinación específica donante-receptor puede resultar en diferentes velocidades de rechazo heterotópico del trasplante de corazón. Las secciones de criostatos de los corazones rechazados revelan una mayor infiltración de células efectores inmunes, mientras que los injertos singénicos están en gran parte libres de células inmunitarias. La linfadenectomía cervical y los ensayos de reestimulación de las células de los ganglios linfáticos drenan después de la inyección de células musculares cardíacas orales revelan respuestas inmunitarias específicas de tensión distintas hacia el tejido cardíaco heterotópico en receptores de trasplantes alogénicos, lo que justifica más análisis inmunológicos, como el perfilado de citoquinas.
Manipule los recipientes con cuidado al insertar y extraer la aguja. No pongas demasiada atención en las suturas para prevenir la estenosis. No coloques demasiados puntos de sutura para cada anastomosis.
