I modelli di trapianto sono strumenti preziosi per la ricerca immunologica che spesso richiedono competenze chirurgiche. Qui, presentiamo un approccio fattibile per il trapianto di cellule cardiache e cardiache eterotopiche nei ratti. Evidenziando e semplificando tutti i passaggi cruciali del nostro modello, i ricercatori senza un background chirurgico dovrebbero essere in grado di padroneggiare questo modello in un lasso di tempo ragionevole.
Entrambi i modelli di trapianto forniscono preziose informazioni sui meccanismi di tolleranza e rifiuto e possono essere applicati in varie specie. Abbiamo molta esperienza nell'insegnare questo modello a individui senza un precedente allenamento chirurgico. Dopo aver appreso i passaggi cruciali, consigliamo pazienza e pratica sufficiente con gli animali deceduti.
Per l'espianto cardiaco donatore, dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale nell'animale donatore di topi di sette-22 settimane anestetizzato, applicare lubrificante per gli occhi e utilizzare tosatrici meccaniche per rimuovere la pelliccia addominale e toracica. Posizionare il topo in posizione supina su una base di riscaldamento e fissare gli arti alla base del tavolo di funzionamento con elastici. Disinfettare la pelle esposta con il 70% di etanolo ed eseguire una laparotomia mediana.
Inserire i retrattili nell'incisione e utilizzare tamponi di cotone sterilizzati per mobilitare l'intestino sul lato sinistro del donatore per esporre la vena cava inferiore. Successivamente, forare la vena cava inferiore per consentire l'iniezione endovenosa di 500 unità internazionali di eparina sciolte in un millilitro di soluzione salina isotonica ghiacciata. Fermare il sanguinamento nel sito perforato dopo la retrazione dell'ago per compressione leggera usando un batuffolo di cotone.
Incidere il diaframma, eseguire una toracotomia laterale su entrambi i lati del donatore e inchiodare la parete del torace. Rimuovere il pericardio e il nervo vagale con una preparazione smussata utilizzando due supporti di micro-ago. Per l'esanguinamento, traslitti i vasi addominali e inserisci il ramo smussato di una sonda forbici appuntite nel seno pericardico trasversale.
Utilizzare un impacco per sezionare l'aorta ascendente e l'arteria polmonare nel modo più distalmente possibile sotto leggera trazione caudale del cuore. Posizionare una singola legatura 5-0 intorno alla vena cava superiore e inferiore e alle vene polmonari e stringere la legatura nel modo più dorsale possibile. Sever il tessuto dorsale alla legatura ed estrarre il cuore.
Per perfondere il cuore espiantato, utilizzare una cannula calibro 18 da un catetere endovenoso per sciacquare 30 millilitri di soluzione salina isotonica ghiacciata integrata con 1000 unità internazionali di eparina attraverso l'aorta ascendente e l'arteria polmonare prima di mettere il cuore in un tubo di soluzione salina da 15 millilitri sul ghiaccio. Dopo aver preparato il ratto ricevente di 10-14 settimane come appena dimostrato, mobilitare l'intestino nella parte superiore sinistra del ricevente su un impacco caldo e bagnato. E regolare il microscopio chirurgico o un'alternativa sufficiente.
Dopo aver mobilitato rispettivamente il duodeno e il giunone prossimale, usando un ingrandimento completo da cinque a sette, utilizzare tamponi di cotone e dissezione smussata per esporre l'aorta addominale e la vena cava inferiore. Utilizzando due supporti di micro ago per elevare i vasi addominali senza ferire le vene lombari, posizionare un morsetto vascolare Cooley sui vasi. Utilizzare una cannula ad arco da 27 gradi da 30 a 45 gradi per forare i vasi addominali.
E usa le forbici Potts per ingrandire il sito di puntura in un'incisione longitudinale che corrisponda alle dimensioni del lume dei vasi donatori. Per rimuovere i coaguli e prevenire la trombosi postoperatoria, perfondere i vasi con soluzione salina e posizionare l'innesto nel situs. Utilizzando due semplici interrotti 8-0 monofilamento suture non riassorbibili, fissare l'aorta ascendente del donatore all'aorta addominale ricevente agli angoli cranici e caudali dell'incisione longitudinale.
Per anastomosi l'aorta ascendente del donatore con l'aorta addominale del ricevente posizionare l'innesto a destra dei vasi riceventi mentre si esegue la prima metà dell'anastomosi con un running 8-0 sutura monofilamento. Quindi posizionare l'innesto a sinistra dei vasi riceventi ed eseguire la seconda metà dell'anastomosi. Fissare l'arteria polmonare del donatore alla vena cava inferiore in modo simile con due nodi angolari agli angoli cranico e caudale.
Dopo aver riparato il vaso donatore con nodi ad ogni angolo, posizionare un punto dall'esterno all'interno del vaso per eseguire un'anastomosi intraluminale per la prima metà dell'anastomosi. Prima di legare la sutura, posizionare un altro punto dall'interno verso l'esterno. Per prevenire l'embolia periferica dopo aver terminato la seconda metà dell'anastomosi, sciacquare l'anastomosi con soluzione salina prima di stringere il nodo della seconda metà dell'anastomosi.
Posizionare una garza emostatica attorno ad entrambe le anastomosi e rilasciare con cura il morsetto vascolare Cooley per consentire la riperfusione dell'innesto. Gestione di eventuali emorragie con compressione leggera e tamponi di cotone sterilizzati. Dopo circa 60 secondi, il cuore dovrebbe iniziare a battere.
Sostituire con cura l'intestino e chiudere la fascia addominale e la pelle con suture di corsa in polifilamento continue separate 3-0. Nel momento sperimentale appropriato, raccogliere un cuore di ratto donatore come dimostrato e utilizzare un bisturi sterile o forbici sterili per distruggere il cuore in tre per tre frammenti millimetrici. Digerire i pezzi in 20 millilitri di mezzo di coltura integrato con 0,5 milligrammi per millilitro di collagenasi per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Alla fine della digestione, aggiungere il tessuto a un setaccio a pori grandi, rimuovendo il mezzo di coltura. Aggiungere da cinque a 10 millilitri di soluzione salina isotonica e filtrare i liquami tissutali attraverso il setaccio. E dopo aver centrifugato la sospensione cellulare due volte, filtrarla attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri.
Risciacquare il colino con da cinque a 10 millilitri di soluzione salina isotonica per raccogliere eventuali cellule rimanenti. E dopo la centrifugazione, rimorsiva le cellule cardiache isolate del ratto in soluzione salina ad una concentrazione di cinque volte 10 alla quinta cellule per millilitro. Caricare una siringa da millilitri con la soluzione cellulare e posizionare l'animale ricevente anestetizzato in posizione laterale con l'orecchio bersaglio rivolto verso l'alto.
Fissare l'orecchio con un dito e un nastro a doppia fronte e utilizzare una cannula calibro 27 per iniettare per via sottocutanea 20 microlitri di soluzione cellulare cardiaca vicino ai vasi capillari visivi nell'orecchio del ricevente. Dopo l'appropriato periodo di osservazione sperimentale, estrarre i linfonodi cervicali drenante ed eseguire le opportune analisi a valle di interesse. I trapianti sinergenici sono sopravvissuti fino a 100 giorni senza segni di insufficienza dell'innesto.
La specifica combinazione donatore-ricevente può comportare diverse velocità di rigetto del trapianto di cuore eterotopico. Le sezioni criostat dei cuori respinti rivelano un aumento dell'infiltrazione delle cellule dell'effettore immunitario, mentre gli innesti sinergici sono in gran parte esenti da cellule immunitarie. La linfoadenectomia cervicale e i test di ristimolazione delle cellule linfonodo drenante dopo l'iniezione orale di cellule muscolari cardiache cardiache rivelano risposte immunitarie specifiche dello sforzo distinte verso il tessuto cardiaco eterotopico nei riceventi di trapianti allogenici, giustificando ulteriori analisi immunologiche come la profilazione della citochina.
Maneggiare attentamente i recipienti quando si inserisce ed estrae l'ago. Non prestare troppa attenzione alle suture per prevenire la stenosi. Non posizionare troppi punti per ogni anastomosi.
