Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento. El objetivo final de la optogenética es la modulación de circuitos neuronales con alta resolución temporal y espacial en el animal que se comporta.
A diferencia de las manipulaciones farmacológicas o eléctricas, la optogenética permite el control preciso de tipos celulares específicos en circuitos neuronales. Optogenetics es la manera perfecta de apuntar a tipos de células específicos en regiones especialmente definidas durante el comportamiento, y examinar el efecto directo de los cambios en dichos microcircuitos. Ahora presentaremos un paso a paso de guía de cómo preparar y plantar y llevar a cabo la optogenética en ratones que se mueven libremente.
Para la preparación del implante óptico, coloque una férula de cerámica plana hacia arriba en una visera de banco. Despoje el código de una fibra de vidrio de 200 micrómetros de diámetro, con una herramienta de desmontaje de fibra y corta de dos a tres centímetros piezas no con un escriba de fibra cerámica. Coloque la pieza de fibra de vidrio en la férula de cerámica y luego coloque una gota de superpegamento en el lado plano con una inyección cannular.
En el lado redondo de la férula de cerámica, corte la fibra de vidrio lo más corta posible y coloque el preimplantaxamiento en un disco de pulido de férula para pulir el lado redondo en cuatro papeles de publicación diferentes. Después, cortar la fibra de vidrio en el lado plano de la férula de cerámica, a la longitud necesaria para la implantación. Utilice un atlas cerebral de ratón para calcular la longitud del implante.
El implante tiene que terminar directamente por encima de la región de interés. Antes de la implantación, se aplica anestesia. La técnica precisa y estética se describe en el manuscrito.
Cuando el ratón alcance un estado profundo de anestesia, colóquelo en una placa calefactora y fije la cabeza en un marco estereotáctico. Fijar la nariz y los dientes en la parte delantera y las orejas en ambos lados. Aplicar una algesia con un cuprofeno subcuntáneamente en la parte posterior del ratón y aplicar un ung ón opaco en ambos ojos para protegerlos del secado.
Humedezca el cabello del cuero cabelludo con una toalla de papel húmeda y luego córtelo con tijeras. Asegúrese de quitar todo el cabello suelto con una toalla de papel húmeda. Use un palo de algodón para desinfectar el cuero cabelludo con una tintura que contenga yodo.
Levante el cuero cabelludo sobre la región de interés con una pinza y corte un centímetro a lo largo de la línea media. Para ásperar el cráneo para su implantación, aplicar una pequeña cantidad de ácido fosfórico en la cicatriz y dejar que surta efecto durante 15 segundos. Retire todo el ácido con un palo de algodón y enjuague la cicatriz con cloruro de sodio dos veces.
Para la inyección adecuada, calcule el factor F para coordenadas individuales. Coloque un cannular de vidrio en el marco estereotácta y localícelo directamente sobre el bregma. Ahora cero el sistema de coordenadas y mover la cánula de vidrio a Lambda.
Calcule el factor F con la siguiente fórmula. Bregma menos Lambda dividido por 4.2 es igual al factor F. Las coordenadas exactas son muy importantes para la inyección y la implantación porque de lo contrario, si se estimula la estructura incorrecta, entonces los efectos conductuales son inespecíficos.
Todos los ratones tienen desviaciones mínimas en el tamaño de su cráneo, por lo tanto, el coeficiente es absolutamente obligatorio. Utilice las coordenadas ajustadas para encontrar la ubicación en la cicatriz directamente por encima de la estructura de interés. Utilice una cánula de inyección para perforar un agujero en el cráneo, girando la cánula en el lugar.
Para tomar una solución vímica en la cánula de vidrio conectada a la jeringa, coloque una gota de cloruro de sodio en el cráneo y un pedazo de pirofeno en la parte superior. Coloque una gota de dos solución de virus microlitsión en el pirofeno y baje la punta de la cánula de vidrio en el virus. Aplique presión negativa y espere hasta que la cánula tome la solución del virus.
Cero a esa coordenada cuando la punta del virus con cánula está en el nivel del cráneo y lentamente bajarlo en el agujero a la posición más baja del lado de inyección. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva con la jeringa hasta que se reduzca el menisco. Deje que el virus se propague durante dos o tres minutos antes de mover la cánula de vidrio hacia arriba a la siguiente posición.
Retire la cánula de vidrio muy lentamente y deséchela después de la inyección final. Ahora prepara el cráneo para la implantación. Seque el cráneo con aire comprimido, aplique la imprimación con este palo correspondiente y déjelo secar durante 15 segundos.
Aplicar el enlace con el mismo palo y curarlo durante 20 segundos con luz UV. Coloque el implante en el soporte correspondiente y coloque la punta de la fibra de vidrio directamente por encima del agujero y ósbralo cuidadosamente. Deja de bajar el implante cuando la válvula restante de superpegamento toque el cráneo.
La implantación de fibras ópticas también se puede hacer para estructuras bilaterales como el hipocampo. Esto permite una ligera estimulación en ambos hemisferios al mismo tiempo o permite la estimulación de dos estructuras diferentes. También es posible inyectar el virus en un lugar diferente del implante de fibra óptica.
Si la inyección y la implantación se están realizando en diferentes regiones, taladre todos los orificios necesarios después de aplicar ácido fosfórico pero antes de la adhesión de los dos componentes. Compruebe de nuevo si el cráneo todavía está completamente seco, luego aplique cemento dental fluido alrededor del implante y en el área circundante y luego cure durante 20 segundos con luz UV Aplique dos cemento más menos en el área del cráneo completamente libre de piel y seca. Cura cada capa con luz UV.
Para terminar la cirugía aplicar un ungido de yodo en toda la herida. Suelte la nariz y la fijación del oído, lleve el ratón a una jaula fresca y colóquelo debajo de una lámpara de calentamiento para evitar la pérdida de calor corporal. Compruebe su estado de salud al menos una vez al día y postoperatorio y algesia después de tres días si es necesario.
Después de dos semanas de recuperación, los ratones se pueden utilizar para experimentos de comportamiento. Abra pulser software y seleccione el puerto de comunicación USB en el que está conectada la fuente de luz. Elija el modo de operación tres para permitir que un software externo controle la fuente de luz.
Elija el ajuste correcto para la estimulación de 20 hercios con un pulso de luz de cinco milisegundos. Para localizar la división para comunicarse con el pulsador, pulse en la secuencia de inicio. Este estado permanecerá hasta que finalicen los experimentos.
Ahora, cree un nuevo experimento en EthoVision XT, vaya a archivo, elija nuevo de la plantilla y seleccione aplicar una plantilla predefinida. Elija el seguimiento en vivo y seleccione la cámara con la fuente y confirme la cámara Puslar Gen-Eye conectada. Elija el ratón como el animal que se debe grabar.
Seleccione la plantilla de arena, el cuadrado de campo abierto y el centro de la plantilla de zona, el borde, las esquinas. Confirme un sujeto que debe ser rastreado y seleccione el punto central, el punto de la nariz y la base de la cola. Confirme que el color del animal en comparación con el fondo es más oscuro y la frecuencia de muestreo recomendada para terminar el paso.
Asigne el nombre apropiado al experimento y elija una ubicación para guardar. Hasta que encuentres los ajustes de la arena, la cámara abrirá automáticamente una imagen de fondo. Adapta las zonas predefinidas a la arena real usando la flecha y los dos símbolos a su derecha.
Si algunas zonas no son necesarias, elimínelas. Presione la escala de dibujo para calibrar y poner una línea de una esquina del laberinto a la otra. Introduzca la longitud de la distancia real en centímetros.
Repita eso para el otro eje. Para definir la configuración del control de prueba, prepare la regla principal ajustando el tiempo de condición a 20 minutos. La condición de Star Trek debe ser, cuando el sujeto está en la arena durante dos segundos, para un estado automático del seguimiento cuando el ratón está en la arena.
Para crear una subreberción para la estimulación de la luz, vaya a estructuras, más y seleccione subreberción. Colóquelo debajo de la regla principal y extienda las dos cajas. Ir a las condiciones, tiempo y darle un nombre como la luz en uno, ajustar la condición se cumple con después de cinco minutos.
Coloque el cuadro directamente detrás del cuadro de inicio de la regla de la subreberción. Vaya a la acción de hardware personalizado y asígnelo con luz en uno. Seleccione la acción para realizar como: Voy a poner una alta.
Coloque la caja directamente detrás del cuadro de condiciones. Repita los pasos para programar la luz a la luz. Ahora vaya a estructuras, referencia de subreberción y compruebe que la referencia pertenece a la subreberción correcta.
Elija las condiciones de inicio como sin demora y las condiciones de inicio como ejecutar una vez por condición de inicio. Coloque el cuadro de referencia entre los libros adicionales uno y acondicione los libros dos de la regla principal. Ahora defina los ajustes de detección para mostrar el sistema de lo que debe rastrear.
Coloque una prueba de millas en la arena y seleccione la configuración automatizada. Elige el roedor como tipo de animal y usa el cursor del ratón para dibujar un cuadro alrededor de los ratones en la arena. Confirme los resultados de la pregunta de atención con sí.
Para el experimento de campo abierto, lleve el ratón experimental a la sala de comportamiento justo antes del experimento para garantizar un nivel adecuado de ansiedad. Acoplar el ratón ser una hendidura de la fuente de luz presionando suavemente a la rejilla de la jaula. Colóquelo en una jaula de espera con camada fresca durante 10 minutos para aclimatarse al cable de luz.
Comience la adquisición pulsando el botón de parada y usted para la visión XT. Transfiera el ratón de la jaula de espera a la esquina superior izquierda del campo abierto. Deje el campo visual del ratón durante el experimento y mantenga la calma. Después de 20 minutos, cuando termine el experimento, retire el ratón del laberinto, desconecte el cable de luz y vuelva a colocarlo en su propia jaula.
Mediante una visualización de comprobación, las diferencias en el tiempo central entre la luz apagada y la luz en las caras se pueden ver directamente. El ratón pasa menos tiempo en el centro cuando la luz está encendida. Para el experimento de laberinto de Barnes, lleve todos los ratones experimentales a la sala de comportamiento alrededor de una hora antes del experimento.
Prepara el laberinto de Barnes cerrando todos los agujeros excepto uno, y ahora que se coloca una caja de escape. Conecte un ratón en la fuente de luz en ambos implantes y colóquelo directamente en el centro del laberinto de Barnes. Pulse start y necesite visitar la siguiente T y retire la caja de cartón.
Esté preparado para detener el ensayo manualmente en caso de que el software no reconozca toda la transición. Saque el ratón del laberinto y retire la conexión al cable de luz. Al realizar, aprender y realizar tareas de memoria, no sólo se investiga el efecto inmediato de la manipulación, sino también el efecto a largo plazo de la manipulación durante la adquisición, consolidación o recuperación.
Para el análisis de datos, encontrará la condición de tratamiento tratada o controlada, vaya a anidamiento y seleccione el estado de control de prueba. Elige el intervalo de estado de la acción de elemento Star Trek a la luz de acción del elemento que se enciende en uno. Coloque la caja de anidación entre el tratamiento de la caja de filtro y el cuadro de resultados correspondiente.
Este intervalo definido es de uno. Repita los pasos para los intervalos en uno de dos y en dos como también para el grupo de control. Defina también los parámetros que se analizarán en el perfil de análisis.
Elija la variable dependiente en la zona y seleccione el centro de la zona, el punto del cuerpo, el punto central y vaya a las estadísticas de prueba. Seleccione la frecuencia, la duración acumulativa y deje allí para ver la primera. Agregue también el movimiento de distancia como variable.
Con este perfil, los datos del tiempo pasado en el centro, las entradas de centro y las entradas de distancia se les permite moverse a distancia. Para extraer datos de cada división, vaya a los resultados y seleccione estadísticas y gráficos, pulse calcular para ver los datos analizados. Pulse exportar datos y seleccione las estadísticas de prueba y la ubicación que desea guardar.
Los datos exportados se guardan como un archivo de Excel y con valores individuales para cada ratón. Además, vaya a la visualización del mapa de calor y presione los mapas de calor de la gráfica, seleccione las pruebas a la derecha para ver los mapas de calor individuales para cada ratón y prueba. Haga clic derecho en el ratón y exporte los mapas de calor como imágenes.
Más tarde, abra el archivo de Excel en el ordenador y calcule la media y los euros estándar SCM para los cuatro ensayos y cada grupo de acondicionamiento medido. Para generar gráficos y trazado Sigma, copie los medios y SCM en el orden correcto desde el archivo adicional a la gráfica Sigma. Las filas tienen que contener los datos de fuera de uno, en uno, y las columnas contienen hercios de prueba, media y SCM.
Seleccione las tres columnas y vaya a crear gráficos. Seleccione el cuadro de barra y elija el cuadro no agrupado con flecha. Etiquete todo el gráfico, vaya a casa, seleccione el cuadro de gráfico y presione exportar.
Seleccione la carpeta de destino y elija el metaarcháculo como formato. Para calcular las estadísticas de los datos obtenidos, copie los datos correctos de Xcel uno en uno, etc. y en columnas individuales de la gráfica Sigma. Marque las columnas que desea comparar e ir al análisis, elija Prueba T y pulse Ejecutar.
Por último, los datos de comportamiento se pueden mostrar divididos en let off y en trial con especialización adicional en mapas de calor. En el experimento de campo abierto, durante la estimulación de la luz de Channelrhodopsin2 y las neuronas piramidales, la duración del centro disminuye, lo que indica un aumento de los niveles de ansiedad. A través de la inmunohistoquímica, se puede determinar el lugar de inyección y la expresión del virus, también en la especificidad en la línea especial del ratón dependiente de Cre.
Se puede ver claramente que la estimulación ligera de Channelrhodopsin2 mejorar las neuronas mentales de esta región corteja específica aumenta los niveles de ansiedad, en comparación con la ansiedad basal antes de esa estimulación. Este efecto inmediato de la manipulación en el comportamiento es la razón por la que optogenético se utiliza hoy en día para tantas preguntas de investigación con respecto al comportamiento. Este procedimiento se puede utilizar para la modulación optogenética de cualquier tipo de célula deseada o circuito neuronal en el cerebro del ratón.
Mediante la combinación de este procedimiento con pruebas de comportamiento adecuadas para su investigación, se puede obtener una visión más profunda de los circuitos neuronales involucrados en comportamientos y enfermedades de interés.
