El protocolo actual contribuye al estudio de los mecanismos cerebrales subyacentes al comportamiento motor calificado. La optogenética inalámbrica permite la manipulación de neuronas específicas mientras los sujetos realizan una tarea en libre movimiento. En combinación con la videografía de alta velocidad, es posible tener un análisis detallado del comportamiento motor fino.
El método podría ayudar a comprender los problemas motores en los trastornos del neurodesarrollo y neurodegenerativos. Estas técnicas también se pueden utilizar para estudiar la función cerebral en otros paradigmas de comportamiento. Diana Rodríguez-Muñoz, una estudiante de pregrado de mi laboratorio, ayudará con el experimento.
Para los procedimientos quirúrgicos, comience preparando una cánula LED de la longitud deseada de acuerdo con las coordenadas dorso-ventrales de la estructura de interés. Para hacerlo, corte la fibra de vidrio a una longitud más larga que el tamaño final deseado y muela la punta de la fibra a la longitud objetivo con papel de lija rugoso. Luego, pule la punta de fibra con papel de lija fina.
Para microinyecciones, llene una pipeta con el aceite mineral y coloque la pipeta en el microinyector. Asegúrese de que el microinyector funcione correctamente inyectando un poco de aceite mineral. A continuación, prepare el ratón anestesiado para la cirugía aplicando una pomada oftálmica y eliminando el vello del cuero cabelludo con un recortador y crema depilatoria.
Luego, limpie el cuero cabelludo con hisopos de algodón con 8% de povidona yodada y 70% de etanol alternados tres veces cada uno. Después de la desinfección, coloque el ratón en el aparato estereotáxico y asegure la cabeza, asegurándose de que el cráneo esté nivelado en los ejes medial-lateral y anterior-posterior. Use un bisturí para hacer una incisión de un centímetro a través del cuero cabelludo a nivel de los ojos a lo largo del eje sagital.
Luego, retraiga la piel para exponer el cráneo y limpie el periostio con hisopos de algodón. Limpie la superficie del cráneo con solución salina e hisopos de algodón y resuelva cualquier sangrado en la superficie con lanzas oculares absorbentes estériles. A continuación, aplica una gota de peróxido de hidrógeno al 2,5% con un hisopo de algodón y deja que actúe durante unos segundos para que las suturas del cráneo sean visibles y tengan una mejor referencia.
Después de unos segundos, limpie el área a fondo con un hisopo de algodón limpio. Con una pipeta de vidrio de 15 micras de diámetro de punta final, localice bregma y lambda para comprobar que el cráneo está nivelado en el eje anterior-posterior. Luego, pinte un punto de referencia en el cuero cabelludo sobre las coordenadas seleccionadas con un marcador.
En el punto de referencia, realice una craneotomía de un milímetro de diámetro aplicando una presión suave al cráneo con una herramienta rotativa a una velocidad baja a media con una broca dental pequeña y redonda. Una vez hecho esto, mueva el capilar hacia las coordenadas anterior-posterior, o AP, y medial-lateral, o ML, seleccionadas. Cargue el capilar con 300 a 400 nanolitros del virus adenoasociado dependiente de CreE, o AAV, como AAV1, D-flox channelrhodopsin mCherry para expresar channelrhodopsin en la región de interés.
Un AAV se puede utilizar como un control para expresar la proteína reportera. Después de asegurarse de que la punta no esté obstruida, introduzca la pipeta de vidrio en el cerebro en las coordenadas dorso-ventrales menos 3,35 milímetros en el estriado dorsal-lateral e inyecte 200 nanolitros del virus utilizando un inyector automático a una velocidad de 23 nanolitros por segundo. Espere 10 minutos después de la inyección antes de retirar la pipeta de vidrio lentamente para evitar derrames.
Luego, limpie y seque cualquier residuo con hisopos de algodón. A continuación, conecte la cánula LED de vidrio al brazo estereotáxico y calibre las coordenadas utilizando bregma como referencia. Luego, inserte la cánula lentamente para evitar daños en los tejidos y colóquela a 100 micrómetros por encima del sitio de inyección.
Una vez que la cánula LED esté en su lugar, agregue una gota de 100 microlitros de adhesivo tisular en el borde de la craneotomía. Use un cepillo estéril para aplicar una mezcla de cemento dental recién preparada alrededor del conector de la cánula poco a poco, construyendo capas hasta que el cráneo esté cubierto y el conector esté firmemente unido al cráneo, dejando los pines completamente libres. Cuando el cemento se seque por completo, cierre la piel alrededor del implante con adhesivo tisular.
Luego, coloque al ratón en una jaula de recuperación sobre una almohadilla térmica a 33 grados centígrados mientras monitorea los signos de incomodidad o dolor. Registre el comportamiento del animal con una cámara normal y capture de 30 a 60 cuadros por segundo desde la parte frontal de la cámara. Se puede colocar un espejo debajo de la cámara de entrenamiento en un ángulo de 45 grados para controlar la postura del animal.
Cuando los ratones comiencen a llegar al pellet, gire la cánula LED manualmente con el control remoto para tener una estimulación continua durante el tiempo que se realiza el comportamiento durante no más de dos segundos. El dispositivo de estimulación activa un LED de 470 nanómetros con intensidad en la punta de un milivatio por milímetro cuadrado. El comportamiento motor fino del animal bajo manipulaciones optogenéticas se estudió con la tarea reach-to-grasp.
Los ratones aprendieron a ejecutar la tarea en un par de días y lograron más del 55% de precisión, alcanzando una meseta después de cinco días de entrenamiento. La trayectoria de los movimientos fue rastreada con videografía de alta velocidad, lo que permitió analizar la cinemática. Se realizó la evaluación cuantificable de parámetros como la distancia recorrida, la velocidad, la aceleración, el punto final y la trayectoria.
En los ensayos perdidos, los ratones comenzaron el movimiento de agarre más lejos del perdigón que los ensayos de golpes. Además, los errores se asociaron significativamente con la postura del ratón, demostrado por las diferencias en el ángulo del cuerpo durante los ensayos de golpes y errores. La activación contralateral de las neuronas de proyección espinosa que expresan dopamina D1, o SPN, redujo el éxito de agarre en comparación con las condiciones de control.
Durante una estimulación optogenética, la trayectoria de la pata aumentó en la distancia de viaje, lo que llevó a la incapacidad de apuntar al pellet y un aumento en el error inicial tipo uno. El análisis de componentes principales, o PCA, mostró que todas las trayectorias de los ensayos durante la activación de los SPN D1 contralaterales se separaron en un grupo casi sin superposición con el grupo de control, lo que indica una baja similitud. La activación de los DSPN en el lado ipsilateral condujo a un aumento en la dispersión de la trayectoria mostrada por el análisis de PCA.
Por lo tanto, la activación de los SPN D1 ipsilateral modificó la trayectoria de alcance sin cambiar el resultado conductual. Al realizar este protocolo, tenga cuidado de colocar la cánula correctamente para que no se desprenda durante las sesiones de entrenamiento. Este método se puede utilizar en otros paradigmas conductuales para estudiar el comportamiento motor, el procesamiento sensorial, el aprendizaje y la memoria.
La optogenética inalámbrica permitirá estudiar el comportamiento naturalista y sus fundamentos neurobiológicos en sujetos verdaderamente en movimiento libre.
