特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。光遺伝学の究極の目標は、行動する動物の高い時間的および空間的分解能を持つ神経回路の変調である。
薬理学的または電気的操作とは対照的に、光遺伝学は、神経回路上の特定の細胞タイプを正確に制御することを可能にする。光遺伝学は、行動中に特別に定義された領域の特定の細胞型を標的とし、そのような微小回路の変化の直接的な影響を精査するのに最適な方法です。次に、自由に動くマウスで光遺伝学を準備し、植え付け、行動するステップガイドのステップを提示します。
光学インプラントの準備のために、ベンチバイスにセラミックフェルール平らな側面を置きます。直径200マイクロメートルのガラス繊維のコードを、繊維剥離ツールで取り除き、セラミックファイバー筆記者で2〜3センチメートルの非部分をカットします。ガラス繊維の一部をセラミックフェルールに入れ、注入角膜で平らな側にスーパーグルーを落とします。
セラミックフェルールの丸い側に、ガラス繊維をできるだけ短くカットし、4つの異なる出版論文で丸い側面を磨くためにフェルール研磨パックにプレインプラントを置きます。その後、セラミックフェルールの平らな側のガラス繊維を、移植に必要な長さにカットします。インプラントの長さを計算するためにマウスの脳アトラスを使用してください。
インプラントは、関心のある領域の真上で終了する必要があります。移植の前に麻酔が適用される。正確で審美的なテクニックは原稿に記載されています。
マウスが麻酔の深い状態に達したら、加熱プレートの上に置き、頭を立体的なフレームに固定します。鼻と歯を前に、耳を両側に固定します。マウスの後ろに下地にクプロフェンを含む藻薬を塗布し、両方の目に不透明な眼軟膏を塗布して乾燥から保護します。
濡れたペーパータオルで頭皮の髪を湿らせ、はさみで切り落とします。濡れたペーパータオルで、ゆる毛をすべて取り除くようにしてください。綿棒を使用して、ヨウ素を含むチンキで頭皮を消毒します。
トゥイザーで関心のある領域についての頭皮を上げ、正中線に沿って1センチメートルをカットします。注入のために頭蓋骨を粗くするには、少量のリン酸を瘢痕に塗布し、15秒間有効にします。綿棒ですべての酸を取り除き、2回塩化ナトリウムで傷跡を洗いすります。
適切な射出のために、個々の座標の F 係数を計算します。立体フレームにガラスのカヌラーを配置し、ブレグマの真上に配置します。座標系をゼロにして、グラスカニューレをラムダに移動します。
次の式を使用して F 係数を計算します。ブレグマからラムダを4.2で割った値はF係数に等しい。正確な座標は、そうでなければ、間違った構造が刺激された場合、行動効果が非特異的であるため、注入および注入にとって非常に重要である。
すべてのマウスは頭蓋骨の大きさに最小偏差を有するため、係数は絶対に必須である。調整された座標を使用して、対象の構造の真上にある傷跡の位置を見つけます。射出カニューレを使用して、頭蓋骨に穴を開け、その場でカニューレを回転させます。
注射器に接続されたガラスカニューレにウイルス溶液を取り込むには、頭蓋骨に塩化ナトリウムを一滴、上にピロフェンを置きます。ピロフェンに2マイクロリットルウイルス溶液を一滴置き、ガラスカニューレの先端をウイルスに下げます。負圧を加え、ウイルス溶液がカニューレに取り込むまで待ちます。
カニューレを持つウイルスの先端が頭蓋骨のレベルにあるときにその座標にゼロし、ゆっくりと注射側の最も低い位置にボアホールにそれを下げる。メニスカスが下がるまで注射器で少量の正圧を加えます。ガラスカニューレを次の位置に上に移動する前に、ウイルスが2〜3分間広がるようにしましょう。
ガラスカニューレを非常にゆっくりと取り出し、最終的な注射後に廃棄します。今、注入のための頭蓋骨を準備します。圧縮空気で頭蓋骨を乾燥させ、この対応するスティックでプライマーを塗布し、15秒間乾燥させます。
同じスティックで結合を適用し、UV光で20秒間硬化させます。インプラントを対応するホルダーに置き、ガラス繊維の先端を穴の真上に置き、慎重に下げます。スーパーグルーの残りのバルブが頭蓋骨に触れたときにインプラントを下げるのをやめてください。
光ファイバーの移植は、海馬のような両側構造のために作ることもできます。これは両方の半球のわずかな刺激を同時に可能にするか、または2つの異なる構造の刺激を可能にする。また、光ファイバーインプラントとは異なる場所でウイルスを注入することもできる。
注射と注入が異なる領域で行われている場合は、リン酸を塗布した後、2つの成分の接着の前にすべての必要な穴を開けます。頭蓋骨がまだ完全に乾燥しているかどうかをもう一度確認し、インプラントの周りと周囲の領域に流体歯科セメントを適用し、UVライトで20秒間治癒し、完全に毛皮のない乾燥した頭蓋骨領域にさらに2つのより少ないセメントを適用します。UV光ですべての層を治す。
手術を終えるために、全創傷にヨウ素のあてがいを塗る。鼻と耳の固定を解除し、新鮮なケージにマウスを持ち込み、加熱ランプの下に置いて体の熱を失わないようにします。少なくとも1日1回は健康状態を確認し、必要に応じて3日後に手術と鎮痛を投稿します。
2週間の回復の後、マウスは行動実験に使用することができる。パルサーソフトウェアを開き、光源が接続されているUSBコムポートを選択します。外部ソフトウェアが光源を制御できるようにするには、操作モード 3 を選択します。
5ミリ秒光パルスで20ヘルツ刺激に対して正しい調整を選択します。パルサーと通信する分割を見つけるには、開始シーケンスを押します。このステータスは、実験が終了するまで残ります。
次に、EthoVision XT で新しい実験を作成し、ファイルに移動し、テンプレートから新しいテンプレートを選択して、定義済みのテンプレートを適用するを選択します。ライブトラッキングを選択し、ソースとカメラを選択し、接続された膿疱のGen-Eyeカムを確認します。記録されるべき動物としてマウスを選択してください。
アリーナテンプレート、オープンフィールドスクエア、ゾーンテンプレートセンター、ボーダー、コーナーを選択します。追跡する必要がある1つの被写体を確認し、中心点、鼻のポイントと尾のベースを選択します。背景と比較して動物の色が暗く、ステップを完了するために推奨サンプルレートを確認します。
適切な名前を実験に指定し、保存する場所を選択します。アリーナの設定が見つかるまで、カメラは自動的に背景画像を開きます。矢印と右の 2 つのシンボルを使用して、定義済みのゾーンを実際のアリーナに適応させます。
一部のゾーンが不要な場合は、削除します。ドロースケールを押してキャリブレーションを行い、迷路の一角からもう一方の角に線を入れます。実距離の長さをセンチメートル単位で入力します。
もう一方の軸についても繰り返します。トライアルコントロール設定を定義するには、条件時間を20分に調整してメインルールを準備します。スタートレックの条件は、被験者がアリーナで2秒間有効な場合、マウスがアリーナにいるときの追跡の自動ステータスです。
光刺激のサブルールを作成するには、構造に移動し、さらにサブルールを選択します。メインルールの下に置き、2つのボックスを広げます。条件に行く、時間と1に光のような名前を与え、調整条件は5分後に満たされます。
サブルールのルール開始ボックスのすぐ後ろにボックスを配置します。アクションカスタムハードウェアに移動し、ライトを持つ名前を付けます。実行するアクションを選択します:私は1つの高を置きます。
ボックスを条件ボックスの真後ろに置きます。ライトオフをプログラムする手順を繰り返します。構造、サブルール参照に移動し、参照が正しいサブルールに属していることを確認します。
開始条件は、開始条件ごとに 1 回実行する場合に、遅延なしの開始条件と開始条件を選択します。追加の本1と条件書の2つのメインルールの間に参照ボックスを配置します。次に、システムが追跡する必要があるものを表示する検出設定を定義します。
アリーナにテストマイルを配置し、自動セットアップを選択します。動物の種類としてげっ歯類を選択し、アリーナでマウスの周りにボックスを描くためにマウスカーソルを使用しています。ケアの質問の結果を確認します。
オープンフィールド実験では、実験の直前に実験用マウスを行動室に持ち込み、適切なレベルの不安を確保します。ケージのグリッドにそっと押して、マウスを光源のスリットに結合します。10分間新鮮なごみで待っているケージに入れて、ライトケーブルに順応させます。
停止ボタンを押して取得を開始し、XTをビジョンにします。待っているケージから開いているフィールドの左上隅にマウスを移動します。実験中にマウスの視野を離れ、落ち着いてください。実験が終了したら20分後、迷路からマウスを取り出し、ライトケーブルを外してケージに戻します。
チェック ビジュアライゼーションにより、面上のライト オフとライトの中心時間の違いが直接見られます。マウスは、ライトが点灯しているとき、中央での時間を短くします。バーンズ迷路実験では、実験の約1時間前にすべての実験用マウスを行動室に持ち込みます。
1つを除くすべての穴を閉じてバーンズの迷路を準備し、今エスケープボックスが配置されています。両方のインプラントで光源に1つのマウスを接続し、バーンズ迷路の真ん中に直接置きます。スタートを押すと、次のTに訪問し、カートンボックスを削除する必要があります。
ソフトウェアが移行全体を認識しない場合に備えて、手動で試用を停止する準備をしてください。迷路からマウスを取り出し、ライトケーブルへの接続を取り外します。実行、学習、および記憶タスクを行う場合、操作の即時効果が調査されるだけでなく、取得、統合または検索中の操作の長期的な影響も調査される。
データ分析では、治療条件を見つけて、入れ子に移動し、試験管理状態を選択します。要素アクションスタートレックから要素アクションライトが1に点灯する状態間隔を選択します。フィルタ ボックス処理と対応する結果ボックスの間にネスト ボックスを配置します。
この定義された間隔は 1 です。2 つのうち 1 つの間隔と、制御グループの 2 つについても繰り返します。また、分析プロファイルで分析するパラメータも定義します。
ゾーン内の従属変数を選択し、ゾーンの中心、ボディポイント、中心点を選択し、試用統計に進みます。頻度、累積期間を選択し、最初の時間を見てみましょう。また、距離移動を変数として追加します。
このプロファイルでは、センターで費やされた時間、中央のエントリ、および距離移動に関する情報のデータが利用可能です。各区分からデータを抽出するには、結果に移動して統計とグラフを選択し、計算を押して分析データを表示します。データのエクスポートを押して、試用統計と保存場所を選択します。
エクスポートされたデータは、Excel ファイルとして保存され、各マウスの個別の値と共に保存されます。さらに、ヒート マップの視覚化に移動し、プロットヒート マップを押し、右側の試験を選択して、各マウスとトライアルの個々のヒート マップを表示します。マウスを右クリックして、ヒートマップをイメージとしてエクスポートします。
その後、Excelファイルコンピュータを開き、4つの試験とすべての測定されたコンディショニンググループの平均と標準ユーロSCMを計算します。グラフとシグマプロットを生成するには、平均とSCMを追加ファイルからシグマプロットに正しい順序でコピーします。行にはオフ 1 のデータが含まれ、列には試用版、平均値、SCM ヘルツが含まれます。
3 つの列をすべて選択し、グラフの作成に進みます。バー ボックスを選択し、矢印付きのグループ化されていないボックスを選択します。グラフ全体にラベルを付け、自宅に移動し、グラフボックスを選択してエクスポートを押します。
保存先のフォルダを選択し、メタファイルをフォーマットとして選択します。取得したデータの統計を計算するには、Xcelから1対1、エトセトラ、およびシグマプロットの単一列に正しいデータをコピーします。比較する列にマークを付けて分析に進み、[T test] を選択して[実行]を押します。
最後に、行動データを、追加のヒートマップ専門化でlet offと試用に分割して表示することができます。オープンフィールド実験では、Channelrhodopsin2および錐体ニューロンの光刺激中に、中心持続時間が減少し、不安レベルの増加を示す。免疫染色法によって、ウイルスの注射部位および発現を決定することができ、また特殊なCre依存マウスラインでの特異性を検証することができる。
1 つは、Channelrhodopsin2 の光刺激は、この特定の皮質領域の心神経細胞を改善することを明確に見ることができます不安レベルを増加させます, その刺激前のベースライン不安と比較して.行動に対するこの操作の直接的な効果は、光遺伝学が行動に関する多くの研究問題に今日使用されている理由です。この手順は、マウス脳内の任意の所望の細胞型または神経回路の光遺伝学的変調に使用することができる。
この手順を研究に適した行動検査と組み合わせることで、目的の行動や病気に関与する神経回路に関するより深い洞察を得ることができます。
