Aquí proporcionamos un protocolo detallado para evaluar las propiedades gratificantes o aversivas de la estimulación genética de una región cerebral específica. La técnica puede responder rápidamente si la estimulación de células específicas es gratificante o aversiva. Describimos la configuración para estimular el área tegmental ventral, pero nuestros protocolos se pueden adaptar fácilmente para cambiar parámetros específicos en términos de diferentes regiones estudiadas.
Para empezar, utilice microcontroladores de una sola placa para controlar la fuente láser. Cargue el script en la placa del microcontrolador utilizando el cable de conexión adecuado al ordenador. El script incluye modulación externa procedente del software de seguimiento a través de una caja TTL, y una salida al láser para controlar los parámetros de estimulación.
Utilice un cable de red para conectar el cuadro TTL a la placa. Asegúrese de que el láser esté configurado para controlarlo mediante modulación externa y conecte el láser a la placa mediante un cable FC/PC. Conecte los pasadores apropiados a las partes de tierra de la placa.
Para conectar la fuente láser a la fibra óptica, conecte primero la fuente láser a una articulación giratoria. Conecte un cable de conexión a la junta giratoria. Estabilice la junta giratoria por encima del aparato, pero fuera del área de grabación.
Asegúrese de que la longitud del cable de conexión de fibra óptica es adecuada para permitir que el ratón se mueva sin dificultades en la arena. Para calibrar la configuración de la arena, utilice una regla para medir una parte específica del aparato físico. En el software, dibuje una línea correspondiente a la pieza medida.
En la pestaña Dibujar escala para calibrar, escriba el valor ya conocido. Diseña la arena, dibuja el área donde se registrará el movimiento de los ratones. Cree las zonas, dibuje las zonas que eventualmente se asignarán como emparejadas con láser, sin combinar con láser y neutrales.
Pulse el botón Validar configuración para validar la configuración para confirmar que no hay parámetros en conflicto, por ejemplo, zonas fuera de la arena. Asegúrese de que el control de hardware está habilitado y establezca la hora del experimento en 30 minutos, en la opción repeat til en la configuración del cuadro de referencia. Asigne un compartimiento como emparejado con láser, en el que la entrada del ratón activará una señal TTL a través del software de seguimiento a la placa del microcontrolador bajo los ajustes de condición.
Para modificar la configuración para el enfoque de preferencia de compartimiento neutro, después de la configuración de arena y hora, asigne las zonas A y B como emparejadas con láser agregando cuando el punto central está en cualquiera de la zona A y la zona B para el cuadro de condición relacionado con los ajustes de los compartimentos A y B. Para configurar los ajustes de detección, utilice un muñeco para parecerse al ratón. Coloque el muñeco en un compartimiento del aparato y utilice la configuración automatizada con resta dinámica.
Retire el muñeco y colóquelo en el compartimento opuesto. Asegúrese de que el maniquí está completamente detectado. Coloque el muñeco en el compartimiento emparejado con láser.
Para comprobar si la estimulación funciona, inicie la adquisición utilizando los ajustes de control de prueba previamente configurados y compruebe si la estimulación se activa como debería. A continuación, coloque el muñeco en el compartimento no parífico o neutro, y vea si la estimulación está detenida. Utilice la perilla del láser para ajustar la potencia del láser a 10 milivatios.
Conecte el implante de fibra óptica al cable de conexión de fibra óptica con un manguito de cerámica y coloque el ratón en el compartimiento neutro del aparato de tres compartimentos. Espere hasta que el software detecte el ratón. Retire las puertas correderas verticales que restringen la entrada del animal en los compartimentos principales.
Permita que el animal explore libremente sin ninguna perturbación. Todo el experimento de preferencias de lugar en tiempo real tiene lugar a lo largo de ocho sesiones. Los ratones DAT-Cre inyectados con el virus AAV channelrhodopsin EYFP en el área tegmental ventral se probaron para atacar las neuronas dopaminérgicas.
Los ratones pasaron en promedio alrededor del 70% de su tiempo en el compartimiento emparejado con láser, a diferencia del compartimento no emparejado en el 20% y el compartimento neutro en 10%Un fenotipo conductual opuesto se observó con ratones Vglut2-Cre inyectados con AAV channelrhodopsin EYFP en el área tegmental ventral. Los ratones evitaron el compartimiento emparejado con la estimulación, y pasaron más tiempo en los no emparejados. Durante las respuestas condicionadas días cinco y ocho, los ratones no mostraron una clara evitación del compartimiento previamente emparejado.
Para demostrar aún más el papel gratificante o aversivo de las neuronas específicas, el método descrito se puede complementar con otros métodos como paradigmas de operón, o subestimulación fotogenética. Preste atención mientras maneja virus y cuando utilice fuentes láser.
