Este trabajo fue apoyado por la Unión Europea del Fondo Europeo de Desarrollo Regional en el marco del Programa Operativo de Desarrollo de Polonia Oriental 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), por la Facultad de Biotecnología y Ciencias Ambientales de la Universidad Católica Juan Pablo II de Lublin (Beca de Jóvenes Científicos para Ilona Sadok), Centro Nacional de Ciencias de Polonia, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 para Magdalena Staniszewska, Investigadora Principal).  Los autores agradecen a la Profesora Agnieszka Ścibior del Laboratorio de Estrés Oxidativo, Centro de Investigación Interdisciplinaria, JPII CUL por compartir el equipo para la cultulación celular y cuantificación de proteínas.

1. Preparación de soluciones estándar de stock estándar 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA
<ol><li>Pesar los reactivos en un vial con la mayor precisión (0,3 mg cada uno). Para una mayor precisión, escale los reactivos, ajustando el volumen del disolvente según el paso 1.2.</li>
	<li>Disolver los reactivos en 300 μL del disolvente para obtener una solución de stock de 1 g/L. Disolver 3NT en 1% (v/v) ácido fórmico (FA) en agua; Kyn, 3HAA y XA en sulfóxido de dimetil (DMSO); 3HQuilino en agua acidificada al pH 2.5 con ácido clorhídrico (HCl). PRECAUCIÓN: 3HAA irrita los ojos, la nariz, la garganta y los pulmones. Es perjudicial cuando se inhala, en contacto con la piel y si se ingiere. Use la protección adecuada, es decir, guantes y máscara.</li>
	<li>Cierre bien el vial y colóquelo en un baño ultrasónico durante 1 minuto para acelerar la disolución. NOTA: Almacene las soluciones de stock a -20 °C y minimice la congelación/descongelación (3 ciclos máximos) debido a la inestabilidad de las soluciones de stock.</li>
</ol>2. Preparación del medio de cultivo tratado con carbón
<ol><li>En un tubo, pesar 280 mg de carbón activado y añadir 5 ml del medio líquido preparado para la cultivo de las células de interés.</li>
	<li>Agitar el tubo con el medio y el carbón en una sierra balancín durante 2 h, a temperatura ambiente (ajuste la velocidad a 50 oscilaciones/min). A continuación, centrífuga los tubos a 6000 x g durante 15 min.</li>
	<li>Retire el tubo de la centrífuga y recoja cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Repita la centrifugación si es necesario, para eliminar todos los residuos de carbón.</li>
	<li>Filtre el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,45 μm.</li>
	<li>Asegúrese de que el medio de cultivo pretratado del carbón se ve privado de rastros de kynurenines mediante la ejecución de una muestra piloto en LC-MS como se describe en el paso 6.3.2. De lo contrario, repita los pasos 2.1-2.4. NOTA: Si el medio de cultivo completo inicialmente no contiene kynurenines, es posible que se omita el paso de purificación que utiliza carbón vegetal. En este caso, prepare los estándares de calibración y las muestras de control de calidad utilizando el medio completo normalmente preparado para la culturing celular.</li>
	<li>Guarde el medio preparado a 4 °C hasta el análisis.</li>
</ol>3. Hacer las soluciones de calibración y curvas de calibración
<ol><li>Pinche el medio de cultivo pretratado de carbón con 0,75 μL de solución 0,1 g/L 3NT y añada cuatro estándares (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) al menos a seis concentraciones diferentes para cubrir los rangos de calibración. Mantenga el volumen final de cada muestra en 150 μL. Utilice tubos centrífugas de 1,5 ml para la preparación de muestras. NOTA: Puntos de calibración sugeridos para 3HKyn: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 μmol/L; para Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; para 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; para XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L.</li>
	<li>Añadir 150 μL de metanol frío (mantenido a -20 °C) que contenga ácido fórmico del 1% (v/v) en cada tubo para la desproteinización de la muestra. Cierre bien los tubos y el vórtice.</li>
	<li>Incubar las muestras a -20 °C durante 40 min.</li>
	<li>Centrífuga las muestras a 14.000 x g durante 15 min a 4 °C. Retire los tubos de la centrífuga. Recoge sobrenautas en los nuevos tubos. No moleste el sedimento.</li>
	<li>Transfiera 270 μL del sobrenadante al vial de vidrio utilizando una pipeta automática. Ponga los viales en el evaporador y evapore suavemente hasta que se sequen. Utilice el programa adecuado para las fracciones de agua/metanol para evaporar componentes volátiles. No aplique temperatura superior a 40 °C y evite el secado excesivo. NOTA: Los viales de vidrio de fondo plano, es decir, los viales cromatográficos facilitan una evaporación más rápida y mayores recuperaciones en comparación con los tubos cónicos plásticos.</li>
	<li>Después de 30 min, compruebe el estado de evaporación. Si es necesario, continúe con la evaporación (por ejemplo, agregue 10 minutos adicionales). Evite el secado excesivo.</li>
	<li>Retire los viales del evaporador. Reconstituir cada muestra en 60 μL de ácido fórmico del 0,1% (v/v) en agua. Agregue el disolvente al vial que contiene el material residual. Cierre bien los viales y el vórtice-pozo.</li>
	<li>Transfiera la muestra a un tubo de 1,5 ml y gire a 14.000 x g durante 15 minutos a 4 °C para separar la proteína precipitada.</li>
	<li>Sin alterar el pellet proteico, transfiera los sobrenautas a viales cromatológicos con insertos cónicos de vidrio con una pipeta automática. Cierre bien los viales.</li>
	<li>Compruebe la presencia de burbujas de aire en el vial de inserción y retírelas si es necesario (por ejemplo, por vórtice).</li>
	<li>Transfiera los viales cromatográficos que contienen muestras al autoamplificador LC. Registre la posición de las muestras colocadas en una bandeja de muestreador automático.</li>
</ol>4. Preparación de muestras de control de calidad (QC)
<ol><li>Pinche el medio de cultivo pretratado con carbón (preparado en un tubo centrífugo de 1,5 ml) con 0,75 μL de solución 0,1 g/L 3NT y estándares de cuatro kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) a una concentración seleccionada del rango lineal de las curvas de calibración. Mantenga el volumen final de la muestra en 150 μL. NOTA: Si procede, prepare varias muestras de control de calidad a diferentes concentraciones que caigan bajo el rango lineal de la curva de calibración.</li>
	<li>Siga el protocolo descrito en la sección 3 (pasos 3.2-3.11).</li>
</ol>5. Configuración del sistema LC-MS
<ol><li>Preparar los disolventes de fase móvil: Disolvente A: formato de amonio de 20 mmol/L en agua ultrapura (pH 4.3 ajustado con ácido fómico); Disolvente B: 100% acetonitrilo. NOTA: Utilice únicamente botellas de vidrio de borosilicato. Enjuague las botellas con agua ultrapura antes de rellenarla. No utilice botellas limpiadas con detergentes. PRECAUCIÓN: La acetonitrilo causa graves efectos sobre la salud o la muerte. Se enciende fácilmente por el calor. El líquido y el vapor de acetonitrilo pueden irritar los ojos, la nariz, la garganta y los pulmones.<ol>
<li>Preparar solución de 5 mol/L de formato de amonio disolviendo un reactivo cristalino (15,77 g) en 50 ml de agua ultrapura en una botella de vidrio. Revuelva hasta que todos los residuos se disuelvan. Filtre a través de la membrana de 0,45 μm para eliminar cualquier residuo residual (por ejemplo, mediante el uso de un filtro de jeringa de nylon). Almacene la solución de stock a 4 °C.</li>
		<li>Prepare el disolvente A añadiendo 4 ml de formato de amonio de 5 mol/L en agua a 980 ml de agua ultrapura en una botella de vidrio ámbar y revuelva bien. Sumerja una barra de agitación y coloque la botella con el disolvente en un agitador magnético. Sumerja un electrodo de pH en la solución y controle el pH bajo agitación. Añadir solución de stock de ácido fórmico (98%-100%) a continuación, con una pipeta automática con punta de 0,2 ml para obtener pH 4.3, ajustar el volumen hasta 1 L con agua ultrapura y revolver bien. NOTA: Prepare los disolventes al menos una vez a la semana para evitar cualquier crecimiento microbiano. PRECAUCIÓN: El ácido fórmico (FA) es tóxico cuando se inhala, causa quemaduras en la piel y daños oculares. Trabajar bajo el capó del humo; usar guantes y abrigos protectores.</li>
		<li>Filtre todas las soluciones a través de la membrana de 0,22 μm (por ejemplo, filtro de jeringa de nylon) para eliminar cualquier residuo residual. Opcionalmente, utilice los filtros de entrada de disolvente dedicados a los depósitos de disolventes LC para proteger el sistema de partículas entrantes.</li>
	</ol></li>
	<li>Inicie el software de control y adquisición de datos LC-MS.</li>
	<li>Purgue el sistema LC con la fase móvil para eliminar burbujas y preparar todos los canales solventes.</li>
	<li>Ensamble una columna de protección para proteger la columna analítica de la obstrucción.</li>
	<li>Enjuague el protector y la columna analítica (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) con acetonitrilo al 100% durante unos 30 minutos, y luego con 100% disolvente A hasta que se observe una presión estable en la columna. Controle el rendimiento del sistema mediante el software de control.</li>
	<li>Fije los parámetros LC apropiados en el software de adquisición de datos.<ol>
<li>Configurar el programa de gradiente: 0-8 min disolvente B 0%; 8-17 min disolvente B 0-2%; 17-20 min disolvente B 2%; 20-32 min disolvente B 10-30%; 32-45 min disolvente B 0%.</li>
		<li>Ajuste el caudal de fase móvil a 0,15 ml/min, el tiempo total de ejecución del análisis durante 45 min, la temperatura de la columna a +40 °C y el volumen de inyección en 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Establezca los parámetros de adquisición del detector de espectrometría de masas.<ol>
<li>Aplicar parámetros de ionización: monitorización de iones únicos (SIM), ionización positiva, presión de nebulizador de 50 psi, +350 °C temperatura de gas de secado, flujo de gas de secado de 12 L/min y voltaje capilar de 5500 V.</li>
		<li>Seleccione los iones de monitoreo de analitos: para 3HKyn m/z 225.0 (período de escaneo: 2-6 min, voltaje fragmentor: 100 V); para Kyn m/z 209.0 (período de escaneo: 6-12 min, voltaje fragmentor: 80 V); para 3HAA m/z 154.0 (período de escaneo: 12-18 min, voltaje fragmentor: 80 V); para 3NT m/z 227.0 (período de escaneo: 18-23 min, voltaje fragmentor: 100 V); para XA m/z 206.0 (período de escaneo: 23-45 min, voltaje fragmentor: 100 V).</li>
	</ol></li>
	<li>Construya un pool de trabajo y ejecute muestras en el sistema LC.</li>
	<li>Al principio, antes del análisis de las muestras experimentales, ejecute una muestra en blanco (SolventE A) al menos en triplicados, seguida de una muestra de control de calidad.</li>
	<li>Abra el software de análisis de datos y cargue los resultados obtenidos para la muestra de control de calidad.</li>
	<li>Compruebe la posición de los picos de analitos en el cromatograma. Cuando las señales se desplazan más allá de la posición esperada, ajuste las puertas de tiempo para la recolección adecuada de señales de analito. Consulte el manual de software para obtener instrucciones sobre la integración de señales.</li>
</ol>6. Construcción de la curva de calibración
<ol><li>En el software de adquisición de datos, añada estándares de calibración al pool de trabajo y ejecute los estándares en triplicados.</li>
	<li>Integre y mida el área pico correspondiente a 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT y XA en el tiempo de retención de aproximadamente 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min y 30 min, respectivamente.</li>
	<li>Construya curvas de calibración individuales para cada metabolito utilizando un programa de hoja de cálculo.<ol>
<li>Para crear el gráfico de calibración, trace el valor de una relación de área pico de analito sobre el área pico 3NT frente a la concentración del analito.</li>
		<li>Analice la muestra en blanco (medio de cultivo pretratado con carbón sólo con 3NT) para asegurarse de que no hay rastro de los analitos estudiados en el medio. De lo contrario, reste el valor obtenido de cada punto de calibración.</li>
		<li>Compruebe la linealidad de cada curva de calibración.<ol>
<li>Individualmente, para cada analito, cree una ecuación lineal de talud-intercepción (y = ax +b), donde y corresponde a la relación de la zona pico de analito frente a la superficie pico 3NT, a es la pendiente, x es la concentración de analito (μmol/L), y b se refiere a la intercepción de curva. Trazar el gráfico 'y' frente a 'x' generará la curva de calibración.</li>
			<li>Agregue una línea de tendencia lineal al gráfico, muestre la ecuación de la curva de calibración y el coeficiente de regresión en el gráfico. Asegúrese de que el coeficiente de regresión sea > 0,990. En caso de estándares de calibración no coincidentes, prepárese y/o analice estos una vez más. Opcionalmente, cambie el rango de concentración de la curva de calibración.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analice las muestras de control de calidad para comprobar el rendimiento del sistema antes de analizar las muestras experimentales. En caso de incompatibilidades (± desviación del 20% del valor de referencia), prepare las nuevas curvas de calibración.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Cultivo celular in vitro y recolección de muestras para su análisis
<ol><li>Plañe las células cancerosas estudiadas (MDA-MB-231 o SK-OV-3) en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) que contengan 4,5 g/L de ᴅ-glucosa, 10% (v/v) suero bovino fetal (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutamina y 1 U penicilina/estreptomicina y cultivo a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% CO2 para expandirlos para el experimento. Pasar las células al 80% de la confluencia.</li>
	<li>Separa las células del plato de cultivo usando trippsina, semilla para el experimento en placas de 12 pozos a una densidad de 0.3 × 106 células por pozo y colóquela en una incubadora durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, aspirar el medio de cultivo y añadir DMEM fresco con o sin la adición de los compuestos estudiados, dependiendo del diseño experimental.</li>
	<li>Después de 48 h, recoja el medio desde arriba de las células (aproximadamente 500 μL) en un tubo de 1,5 ml. Centrífuga a 14.000 x g durante 5 minutos para eliminar los restos celulares. Recoge el sobrenadante y guárdalo a -80 °C hasta el análisis.</li>
	<li>Guarde el pellet celular del paso 7.4 para la estimación de proteínas. Congele las muestras a -20 °C. NOTA: Los resultados obtenidos para un medio de diferentes pozos deben normalizarse al contenido total de proteínas para tener en cuenta la variabilidad en el número de células en pozos individuales. La concentración de proteínas se puede evaluar como se describe en el paso 9.</li>
</ol>8. Preparar muestras para el análisis de LC-MS
<ol><li>Descongele la muestra congelada a temperatura ambiente y mezcle bien. Transfiera 149,25 μL del medio de cultivo a un tubo de centrifugación (1,5 ml).</li>
	<li>Añadir 0,75 μL de 0,1 g/L de solución 3NT (estándar interno). Cierre bien los tubos y el vórtice.</li>
	<li>Añadir 150 μL de refrigerado a -20 °C de metanol que contiene 1% (v/v) FA para la desproteinización de muestras. Cierre bien los tubos y el vórtice.</li>
	<li>Continúe con la preparación de muestras como se describe en la sección 3 (pasos 3.3-3.11). NOTA: Algunas células cancerosas como SK-OV-3 secretan grandes cantidades de Kyn en un medio de cultivo. Para ajustar los datos a un rango lineal de la curva de calibración, es necesaria una dilución aproximadamente 100 veces de la muestra. En este caso, diluya una porción de la muestra con FA del 0,1% (v/v) en agua y analice además de la muestra sin diluir. Las muestras de referencia de las normas para la curva de calibración deben prepararse en un medio de cultivo completo diluido 100 veces. Alternativamente, agregue más puntos en la curva de calibración (si se logra la solubilidad y linealidad adecuadas) para ajustarla al nivel de concentración de Kyn en la muestra experimental.</li>
	<li>Analice las muestras por LC-MS como se describe en la sección 5. Construya un pool de trabajo y ejecute cada muestra en triplicado.</li>
	<li>Una vez completado el pool de trabajo, mida el área pico del analito.</li>
	<li>Genere una hoja de cálculo utilizando el software disponible y los datos numéricos de obtención.</li>
	<li>En una columna de hoja de cálculo calcular la relación del área pico de analito sobre el área pico 3NT.</li>
	<li>Utilice una ecuación de calibración lineal individual dedicada a cada analito (a partir del paso 6.3.) para calcular las concentraciones de analitos presentes en las muestras experimentales.</li>
</ol>9. Evaluación del contenido de proteínas y normalización de datos
<ol><li>Resuspend el pellet celular desde el paso 7.5 con 100 μL de solución salina amortiguada por fosfato (PBS) en tubo de 1.5 mL. NOTA: Preparar la solución PBS disolviendo 8 g de cloruro sódico, 0,2 g de cloruro de potasio, 1,44 g de fosfato sódico dibasico, fosfato dihidrógeno de potasio en 950 ml de agua ultrapura. Revuelve bien. Ajuste el pH a 7,4 con ácido clorhídrico (gota a gota). Ajuste el volumen hasta 1 L con agua ultrapura. Revuelva bien hasta que esté homogéneo. PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico es altamente corrosivo y debe manipularse con las precauciones de seguridad adecuadas. El contacto con la piel humana puede causar enrojecimiento, dolor, quemaduras en la piel. Trabajar bajo el capó del humo; usar guantes y abrigos protectores.</li>
	<li>Congele las muestras a -20 °C y luego descongele sobre hielo. Repita este paso 3x.</li>
	<li>Centrífuga las muestras a 14.000 x g durante 15 min a 4 °C. Recoge los sobrenadantes en los nuevos tubos. No moleste el pellet.</li>
	<li>Diluir los sobrenadantes 10x con PBS.</li>
	<li>Construir una curva de calibración de 0 a 2 μg de la proteína por rango de pozo.<ol>
<li>Prepare la solución estándar de albúmina sérica bovina (BSA) para la calibración. Disolver 1,23 μg de BSA en 1 ml de agua ultrapura y vórtice bien.</li>
		<li>En una placa de 96 pozos, cargue diferentes cantidades de solución estándar BSA (1,23 μg/ml): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.</li>
		<li>Llene el pozo con PBS hasta el volumen final de 50 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cargue de 10 a 15 μL de lisato celular desde el paso 9.4 en la misma placa de 96 pozos. Llene los pozos con PBS para alcanzar el volumen final de 50 μL. NOTA: Si es necesario, ajuste el volumen de la licuada de la célula en cada pozo para que encaje en el rango lineal de la curva de calibración. Mantenga el volumen final a 50 μL de la muestra por pozo.</li>
	<li>Añadir 200 μL de un reactivo bradford (diluido 5 veces con agua ultrapura) a cada pozo.</li>
	<li>Incuba el paté de 96 pozos durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente. Inserte la placa en un lector de microplacas. Mida la absorbancia a λ = 595 nm.</li>
	<li>Construya una curva de calibración utilizando un programa de hoja de cálculo. Trace la cantidad BSA (μg) frente a la absorbancia. Agregue una línea de tendencia lineal, muestre la ecuación de la curva de calibración y el coeficiente de regresión en el gráfico.</li>
	<li>Utilice la ecuación lineal (y = ax +b, donde y corresponde a la absorbancia a λ = 595 nm, a es la pendiente, x es un contenido proteico (μg), y b se refiere a la intercepción de curva) para calcular la cantidad de proteína en la muestra. NOTA: Considere un factor de dilución de la muestra en los cálculos.</li>
	<li>Utilice el contenido estimado de proteínas para normalizar la cantidad de kynurenina en la muestra por 1 mg de proteína. Para ello, divida la concentración de kynureninas determinada en el paso 8.9 con el contenido total de proteínas del paso 9.10.</li>
</ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+tryptophan+metabolites.">Chromatographic analysis of tryptophan metabolites.</a> Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).</li><li>Fuertig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS-based+quantification+of+kynurenine+metabolites,+tryptophan,+monoamines+and+neopterin+in+plasma,+cerebrospinal+fluid+and+brain.">LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain.</a> Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).</li><li>Marcos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tryptophan+and+tyrosine+metabolism+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).</li><li>M&#246;ller, M., Du Preez, J., Harvey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+single+analytical+method+for+the+determination+of+tryptophan,+and+its+kynurenine+metabolites+in+rat+plasma.">Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).</li><li>Lesniak, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+quantification+of+tryptophan+and+its+major+metabolites.">Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites.</a> Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).</li><li>Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isocratic+liquid+chromatographic+separation+and+quantification+of+tryptophan+and+six+kynurenine+metabolites+in+biological+samples+with+ultraviolet+and+fluorimetric+detection.">Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection.</a> International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).</li><li>Vignau, J., Jacquemont, M. 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K., Ravid, K., Chitalia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric+method+for+quantification+of+tryptophan-derived+uremic+solutes+in+human+serum.">A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum.</a> Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).</li><li>Arnhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+liquid+chromatography-high+resolution-tandem+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+quantitation+of+tryptophan,+kynurenine,+kynurenic+acid,+and+quinolinic+acid+in+human+plasma.">A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma.</a> Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).</li><li>Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+profiling+of+tryptophan+and+its+related+metabolites+in+patients+with+metabolic+syndrome+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+LC-MS/MS+method+for+determination+of+kynurenine+and+tryptophan+concentrations+in+human+plasma+from+HIV-infected+patients.">A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients.</a> Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).</li><li>Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+tryptophan+and+related+compounds+by+liquid+chromatography/electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+tryptophan+metabolites+in+serum,+urine,+and+cell+culture+supernatants+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).</li><li>Hashioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+analysis+implies+noninvolvement+of+the+kynurenine+pathway+neurotoxins+in+the+interferon-gamma-+induced+neurotoxicity+of+adult+human+astrocytes.">Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes.</a> Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).</li><li>Sadok, I., Rachwa&#322;, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+optimized+and+validated+LC-MS+method+for+simultaneous+quantification+of+tryptophan+metabolites+in+culture+medium+from+cancer+cells.">Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).</li><li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+suppression+in+mass+spectrometry.">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li><li>Hou&#233;e-L&#233;vin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+oxidative+modifications+of+tyrosine:+An+update+on+mechanisms+of+formation,+advances+in+analysis+and+biological+consequences.">Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences.</a> Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Expression+of+Indoleamine+2,+3-Dioxygenase+in+Human+Recurrent+Miscarriage.">Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage.</a> Reproductive Sciences. , (2019).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+in+nasopharyngeal+carcinoma+impairs+the+cytolytic+function+of+peripheral+blood+lymphocytes.">Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes.</a> BMC Cancer. 9, 416 (2009).</li><li>Mailankot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoleamine+2,3-dioxygenase+overexpression+causes+kynurenine-modification+of+proteins,+fiber+cell+apoptosis+and+cataract+formation+in+the+mouse+lens.">Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este documento presenta un protocolo detallado LC-SQ para la cuantificación simultánea de cuatro metabolitos Trp principales (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) que se miden en un medio a partir de células cancerosas humanas cultivadas in vitro. Se presta especial atención a la preparación de la muestra, el procedimiento de espectrometría cromatográfica/de masas y la interpretación de datos, los puntos más importantes dentro del análisis.
En general, el análisis LC-MS, debido a la alta ...

La vía kynurenina (KP) es la principal ruta del catabolismo del triptófano (Trp) en las células humanas. Indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO-1) en células extrahepáticas es la primera enzima limitante de KP y convierte Trp en N-formylkynurenine1. Otros pasos dentro de KP generan otros metabolitos secundarios, a saber, kynurenines que exhiben varias propiedades biológicas. Kynurenine (Kyn) es el primer catabolito Trp estable que muestra propiedades tóxicas y regula los eventos celulares después de unirse al receptor de hidrocarburos aryl (AhR)2. Posteriormente, Kyn se transforma en varias moléculas, ya sea espontáneamente o en los procesos mediados por enzimas, generando tales metabolitos como 3-hidroxikynurenine (3HKyn), ácido anthranilic (AA), ácido 3-hidroxiykynurenlic (3-HAA), ácido kynurenic (Kyna), y ácido xanthurenic (XA). Otro metabolito aguas abajo, 2-amino-3-ácido carboxímuconico-6-semialdehído (ACMS), se somete a cíclico no enzimático al ácido quinolinico (QA) o ácido picolínico (PA)1. Por último, qa se transforma aún más en nicotinamida-adenina dinucleótido (NAD+)3, el metabolito de punto final KP que es un cofactor enzimático importante. Algunas kynurenines tienen propiedades neuroprotectoras como Kyna y PA, mientras que las otras, es decir, 3HAA y 3HKyn, son tóxicas4. Ácido xanthurenic, que se forma a partir de 3HKyn, presenta propiedades antioxidantes y vasorelaxación5. XA se acumula en lentes de envejecimiento y conduce a la apoptosis de células epiteliales6. KP, descrito a mediados delsiglo XX, ganó más atención cuando se demostró su participación en varios trastornos. El aumento de la actividad de esta vía metabólica y la acumulación de algunas kynureninas modulan la respuesta inmune y se asocian con diferentes condiciones patológicas como depresión, esquizofrenia, encefalopatía, VIH, demencia, esclerosis lateral amiotrófica, malaria, Alzheimer, enfermedad de Huntington y cáncer4,7. Algunos cambios en el metabolismo del Trp se observan en microambientes tumorales y células cancerosas2,8. Además, las kynurenines se consideran marcadores prometedores de la enfermedad9. En la investigación del cáncer, los modelos de cultivo celular in vitro están bien establecidos y ampliamente utilizados para la evaluación preclínica de las respuestas a los medicamentos contra el cáncer10. Los metabolitos Trp son secretados por las células en el medio de cultivo y se pueden medir para evaluar el estado de la vía kynurenina. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos adecuados para la detección simultánea de tantos metabolitos KP como sea posible en una variedad de especímenes biológicos con un protocolo fácil, flexible y confiable.
En este artículo, describimos un protocolo para la determinación simultánea de cuatro metabolitos de vía kynurenina: Kyn, 3HKyn, 3HAA y XA por LC-SQ en un medio post-cultivo recogido de células cancerosas. En un enfoque analítico moderno, se prefiere la cromatografía líquida13,14,15,16 para la detección y cuantificación simultánea de los catabolitos de triptófano individuales, en contraste con los ensayos bioquímicos no específicos utilizando el reactivo Ehrlich11,12. En la actualidad, existen muchos métodos disponibles para la determinación de kynureninas en muestras humanas, principalmente basados en cromatografía líquida con detectores ultravioleta o de fluorescencia13,17,18,19. La cromatografía líquida junto con un detector de espectrometría de masas (LC-MS) parece más adecuada para este tipo de análisis, debido a su mayor sensibilidad (límites más bajos de detección), selectividad y repetibilidad.
Los metabolitos Trp ya se han determinado en suero humano, plasma y orina13,20,21,22,23,sin embargo, también se desean los métodos para otros especímenes biológicos, como el medio de cultivo celular. Anteriormente, LC-MS se utilizaba para compuestos derivados de Trp en un medio recogido después de la cultión de células de glioma humano, monocitos, células dendríticas o astrocitos tratados con gamma interferón (IFN-γ)24,25,26. Actualmente, existe la necesidad de nuevos protocolos validados que permitan una evaluación de varios metabolitos en diferentes medios de cultivo, células y tratamientos utilizados en modelos de cáncer.
El propósito del método desarrollado es cuantificar (dentro de una ejecución analítica) cuatro kynureninas principales que pueden indicar anomalías en KP. Aquí se presentan pasos críticos de nuestro protocolo recientemente publicado para el análisis cuantitativo LC-SQ de kynureninas significativas seleccionadas utilizando un estándar interno (3-nitrotirosina, 3NT) en el medio recogido de las células de cáncer humano cultivadas in vitro 27. Hasta donde sabemos, es el primer protocolo LC-SQ para la cuantificación simultánea de 3HKyn, 3HAA, Kyn y XA en un medio de cultivo obtenido de las células adultas in vitro. Tras algunas modificaciones, el método podría aplicarse aún más para estudiar los cambios en el metabolismo de Trp en una gama más amplia de modelos de cultivo celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1360px;" width="1359">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-hydroksy-DL-kynurenina</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">H1771</td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-hydroxyanthranilic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">148776</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>1.00029</td>
			<td>hypergrade for LC-MS LiChrosolv</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>05105</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:175px;">Ohaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:411px;">Analytical column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>959764-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium formate</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">7022</td>
			<td>eluent additive for LC-MS, LiChropur, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>1001887398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caps for chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>blue screw caps,PTFE/red sil sepa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>704004</td>
			<td>polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td style="width:175px;">Biologix</td>
			<td>07-6012</td>
			<td>12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>HERAcell 150i Cu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5415R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5428</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-2278</td>
			<td>Eppendorf type, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-3693</td>
			<td>Falcon type, 50 mL, PP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic data acqusition and analysis software</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic insert vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-1387</td>
			<td>100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0714</td>
			<td>2 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">1.02950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dubelcco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:175px;">PAN Biotech</td>
			<td>P04-41450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dual meter pH/conductivity</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>SevenMulti</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evaporator</td>
			<td style="width:175px;">Genevac</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model EZ-2.3 Elite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Formic acid</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">5.33002</td>
			<td>for LC-MS LiChropur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Glass bottle for reagents storage</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>S-2070</td>
			<td>50 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Guard column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">959757-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">L-kynurenine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">K8625</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:175px;">Wigo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>ES 21 H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microbalance</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td>model XP6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Milli-Q system</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td>ZRQSVPO30</td>
			<td>Direct-Q 3 UV with Pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quadrupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G1948B</td>
			<td>model 6120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Adrich</td>
			<td>048M4874V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:175px;">Bio Tek</td>
			<td></td>
			<td>Synergy 2 operated by Gen5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.05108.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td style="width:175px;">BioRad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">See-saw rocker</td>
			<td style="width:175px;">Stuart</td>
			<td>SSL4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipette</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>326001</td>
			<td>5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent inlet filter</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5041-2168</td>
			<td>glass filter, 20 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6524</td>
			<td>1 L, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6526</td>
			<td>1 L, amber glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet program</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stir bar</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-2003</td>
			<td>teflon coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for culture medium filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>7-8803</td>
			<td>regenerated cellulose, &#216; 30 mm, 0,45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for mobile phase components filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-0018</td>
			<td>nylon, &#216; 30 mm, 0,22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>96-wells, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrih</td>
			<td>T4049-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:411px;">Ultra-High Performance Liquid Chromatography system</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">G1367D, G1379B, G1312B, G1316C</td>
			<td style="width:513px;">1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasound bath</td>
			<td>Polsonic</td>
			<td>104533</td>
			<td>model 6D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>Biosan</td>
			<td></td>
			<td>model V-1 plus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">D120804</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures

La vía kynurenina y los catabolitos de triptófano llamados kynurenines han recibido mayor atención por su participación en la regulación inmune y la biología del cáncer. Un ensayo de cultivo celular in vitro se utiliza a menudo para aprender sobre la contribución de diferentes catabolitos de triptófano en un mecanismo de la enfermedad y para probar estrategias terapéuticas. Medio de cultivo celular que es rico en metabolitos secretados y moléculas de señalización refleja el estado del metabolismo del triptófano y otros eventos celulares. Se desean nuevos protocolos para la cuantificación confiable de múltiples kynurenines en el complejo medio de cultivo celular para permitir un análisis fiable y rápido de múltiples muestras. Esto se puede lograr con cromatografía líquida junto con espectrometría de masas. Esta potente técnica se emplea en muchos laboratorios clínicos y de investigación para la cuantificación de metabolitos y se puede utilizar para medir kynurenines.
Aquí se presenta el uso de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas de cuadrúpedo único (LC-SQ) para la determinación simultánea de cuatro kynureninas, es decir, kynurenina, 3-hidroxikynurenina, 3-hidroxiyanthranilic, y ácido xanthurenic en el medio recogido de células cancerosas cultivadas in vitro. Sq detector es fácil de usar y menos costoso en comparación con otros espectrómetros de masa. En el análisis SQ-MS, se generan y separan varios iones de la muestra según su relación de masa a carga específica(m/z),seguida de la detección mediante un modo de supervisión de iones únicos (SIM).
Este documento llama la atención sobre las ventajas del método notificado e indica algunos puntos débiles. Se centra en elementos críticos del análisis LC-SQ, incluida la preparación de muestras junto con la cromatografía y el análisis de espectrometría de masas. También se discuten el control de calidad, las condiciones de calibración del método y los problemas de efecto de matriz. Describimos una simple aplicación de 3-nitrotirosina como un estándar analógico para todos los analitos de destino. Como confirman los experimentos con óvulos humanos y células de cáncer de mama, el método LC-SQ propuesto genera resultados confiables y se puede aplicar aún más a otros modelos celulares in vitro.

LC-MS presenta ventajas indiscutibles en la cuantificación de moléculas biológicamente activas, a pesar de que algunos componentes de especímenes complejos causan los llamados efectos de matriz y comprometen la ionización de analitos. Conduce a la supresión de iones o mejora de iones, disminuyendo fuertemente la precisión y afectando a un límite de detección/cuantificación de LC-MS, que se considera como un punto ''débil' del método. En nuestro protocolo, los iones son generados por la ionización de electros...

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Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Aquí se describe un protocolo para la determinación de cuatro metabolitos triptófanos diferentes generados en la vía kynurenina (kynurenina, 3-hidroxikynurenina, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxiyanthranilic) en el medio recogido de cultivos celulares cancerosos analizados por cromatografía líquida junto con una sola espectrometría de masa cuadrúpeda.

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

simultaneous-quantification-selected-kynurenines-analyzed-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.3K vistas.  The John Paul II Catholic University of Lublin. Aquí se describe un protocolo para la determinación de cuatro metabolitos triptófanos diferentes generados en la vía kynurenina (kynurenina, 3-hidroxikynurenina, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxiyanthranilic) en el medio recogido de cultivos celulares cancerosos analizados por cromatografía líquida junto con una sola espectrometría de masa cuadrúpeda.

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Investigación

Bioingeniería

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

La cuantificación de la función diastólica por Global Análisis basado en Modelado cinemático de flujo transmitral mediante el formalismo de llenado diastólico parametrizada

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Preparación de la muestra Estrategias para Espectrometría de Masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3D

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

Generación de Scalable, metálico de alta Aspect Ratio nanocompuestos en una Biológica Medio Líquido

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizado de montaje robotizada manipulación líquido de dispositivos modulares de la DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Síntesis de biocompatibles de cristal líquido de elastómero Espumas como andamios celulares para 3D espaciales Cultivos Celulares

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among adults. High quality, reproducible research on the consequences of electronic cigarette use is essential for understanding emerging public health concerns and crafting evidence based regulatory policy. While a growing number of papers discuss electronic cigarettes, there is little consistency in methods across groups and very little consensus on results. Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This protocol details instructions for the assembly and operation of said device, and demonstrates the use of the generated extract in two sample applications: an in vitro cell viability assay and gas-chromatography mass-spectrometry. This method provides a tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This method provides a useful tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Un microcontrolador funciona dispositivo para la generación de extractos líquidos de Aerosol de humo y electrónicos cigarrillo cigarrillo convencional

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...