La simulación dinámica molecular es una técnica computacional que se puede utilizar para explorar movimientos moleculares y puede revelar cambios conformacionales cruciales para entender la función bioquímica y celular. Es difícil sondear el rango de movimientos dinámicos accesibles a una macromolécula. El uso de los resultados de las simulaciones dinámicas moleculares junto con los datos experimentales permite evaluar su importancia funcional.
Demostraremos mediante simulaciones dinámicas moleculares cómo las mutaciones observadas en pacientes con cáncer afectan a las confirmaciones de metas de EGFR y la unión de ligandos. Para preparar el EGFR activo apo de tipo salvaje nuestra estructura quinasa, abra el programa de visualización Kymera y, en el menú de archivos, haga clic en fetch by ID.Select the Protein Data Bank database y especifique el código Protein Data Bank 2GS2. Para construir los elementos 2GS2 estructurales que faltan, adquiera estos segmentos de otras estructuras EGFR.
Para construir el glutamato de cinco residuos 746 a la eliminación de ALANina 750 ELREA en EGFR, haga clic en favorito, secuencia y mostrar secuencia para abrir la secuencia de tipo salvaje 2GS2. Y en la ventana de secuencia resultante, haga clic en editar y agregar secuencia para seleccionar la secuencia de formato FASTA mutante de eliminación. En la ventana de alineación, seleccione la estructura y el modelo o homología.
En la ventana emergente, especifique la estructura compuesta 2GS2 como plantilla y la secuencia mutante como la consulta que se va a modelar y, a continuación, seleccione un modelo mutante de los modelos resultantes en función de la puntuación zDOPE y la inspección visual. Para preparar la estructura de quinasa EGFR inactiva de tipo salvaje, abra la estructura 2GS7 del Banco de Datos de Proteínas y agregue los segmentos que faltan de las otras estructuras EGFR, modelando la forma mutante de eliminación como se ha demostrado. Para preparar la estructura activa de quinasa EGFR de tipo salvaje ligada a ATP, utilice la estructura 2ITX del banco de datos de proteínas como estructura principal, construyendo los segmentos que faltan utilizando otras estructuras EGFR y modelando la forma mutante de eliminación utilizando el modelador como se ha demostrado.
Para construir la estructura de dimer asimétrico EGFR de tipo salvaje, abra 2GS2 en Kymera y haga clic en herramientas, estructura de orden superior y celda de unidad para convertir la estructura en el ensamblaje biológico que contiene el activador y las quinasas del receptor en la disposición asimétrica. Seleccione la estructura 2GS2 e introduzca hacer copias, luego seleccione y guarde un único dimer asimétrico de las múltiples copias del dimer resultante de las operaciones de simetría. Para construir el mutante de alanina 702 valine, seleccione herramientas, edición de estructura y rotadores para reemplazar la alanina 702 por valina.
Abra las estructuras en Maestro y haga clic en el botón del asistente de preparación de proteínas, luego seleccione Agregar átomos de hidrógeno y rellene los átomos de cadena lateral que faltan y haga clic en Preprocesar. Para determinar los estados de protonación de residuos ionizables a pH 7.0, haga clic en refinar y utilice PROPKA para optimizar la orientación de los residuos de asparagina, glutamina e histamina para la unión de hidrógeno y, a continuación, minimice la estructura. Para configurar el sistema de simulación, abra el programa LEAP e importe el campo de fuerza Amber FF14SB y las moléculas de agua TIP3P.
Para los sistemas enlazados a ATP, importe parámetros para ATP y cargue la estructura. Solvate la estructura en una caja octahedral con moléculas de agua TIP3P explícitas que extiende 10 angstroms en todas las direcciones de los átomos superficiales de la proteína. Compruebe el sistema de correas y añada los iones necesarios para neutralizarlo.
Para modelar suficientemente los sistemas biomoleculares, añada átomos adicionales de sodio y cloruro a la caja de simulación para llevar la concentración de sal del sistema a 0,15 molares, luego genere y guarde la topología y los archivos de coordenadas del sistema para que sirvan como entradas para la simulación de producción posterior. Usando Amber, inicialmente la energía minimiza el sistema de simulación para eludir cualquier configuración desfavorable. En el archivo de entrada de minimización, ajuste la variable de ciclo máximo para el ciclo de minimización total y el número de ciclos para indicar el número de ciclos para el algoritmo de descenso más pronunciado.
Utilice la variable de peso de restricción para aplicar la fuerza de restricción en los átomos de soluto especificados por el parámetro de máscara de restricción. Llevar a cabo la minimización en múltiples pasos, bajando gradualmente la restricción aplicada en los átomos de soluto de 25 a 0 kilocalorías por mole angstrom cuadrado, a continuación, utilice el comando para ejecutar la minimización. Calienta el sistema durante 100 picosegundos de 0 a 300 Kelvin y usa los comandos para establecer una restricción de angstrom de 10 kilocalories por acustrom cuadrada en átomos de soluto.
A continuación, utilice el comando para llevar a cabo la calefacción. Equilibrar el sistema para 900 picosegundos bajo un conjunto isobárico isotérmico y establecer un límite de distancia de angstrom de nueve para interacciones electrostáticas de largo alcance, reducir gradualmente la restricción del átomo de soluto a 0,1 kilocaloría por mole angstrom cuadrado y finalizar el equilibrio con una simulación de cinco nanosegundos sin restricciones. Ejecute la ecualización con el comando como se indica.
Ajuste el texto para permitir que la simulación de producción se lleve a cabo durante 100 nanosegundos con las conformaciones que se guardan cada 10 picosegundos y, a continuación, ejecute la simulación con el comando como se indica. Para visualizar la muestra de conformación durante las simulaciones de quinasa EGFR mutante y de tipo comodín, abra los archivos de topología Amber y los archivos de trayectoria correspondientes en Visual Molecular Dynamics. Y utilizando convenientes representaciones de estructura secundaria, analice la dinámica estructural general de las proteínas a partir de la trayectoria registrada.
A continuación, vea interacciones específicas entre átomos y residuos de interés, como el puente de sal de lisina 745-glutamato 762 catáticamente esencial. Alternativamente, guarde múltiples conformaciones muestreadas durante la simulación en formato Protein Data Bank y abra las conformaciones en Kymera. Utilice la opción de emparejamiento para superponer las estructuras de la estructura inicial o mediana y mostrar la estructura mediana en sólido y el resto de las estructuras alineadas en blanco descolorido para permitir la visualización de los movimientos estructurales registrados con más claridad.
Para analizar la estabilidad global de los EGFR mutantes y de tipo salvaje y examinar la flexibilidad de las diferentes unidades estructurales, importe la tipología Amber y los archivos de trayectoria correspondientes. En el archivo de entrada de desviación cuadrada media raíz, indique los átomos de la estructura básica como referencia para el empalme cuadrado medio raíz. En el archivo de entrada de fluctuación cuadrada media raíz, indique los átomos C-alfa de la estructura inicial como referencia para el empalme cuadrado medio raíz.
A continuación, ejecute el análisis con el programa CPPTRAJ y trace los datos de salida. Alternativamente, para alinear los conjuntos conformacionales y colorear cada residuo basado en la desviación cuadrada media de la raíz del átomo C-alfa, abra las conformaciones en Kymera y alinee con la opción de emparejamiento. Seleccione herramientas, representación y renderice por atributo.
Seleccione los residuos de los conjuntos conformacionales y establezca la desviación cuadrada media de la raíz C-alfa como los atributos y, a continuación, haga clic en Aceptar. El trazado de cadena de las conformaciones será de color azul, blanco o rojo que refleja las regiones de alta, media y baja estabilidad estructural respectivamente. Para analizar las interacciones de enlace de hidrógeno entre ATP y tanto EGFR de tipo salvaje como de eliminación, prepare un script CPPTRAJ para llevar a cabo esta tarea. Especifique el análisis para los enlaces intermoleculares de hidrógeno solo con la variable nointramol y defina un enlace de hidrógeno con una distancia de aceptación del donante menor o igual a 3,5 angstroms y un ángulo de unión mayor o igual a 135 grados.
Para evaluar las interacciones intramoleculares, por ejemplo, entre los residuos de lisina y glutamato catáticamente importantes, especifique la lisina como donante de hidrógeno y glutamato como residuos aceptadores y ejecute el script como se indica para permitir el análisis del resultado. Para calcular las energías libres de unión entre ATP y tanto EGFR de tipo salvaje como de eliminación, prepare el receptor de ligando de fase gasal y los archivos del banco de datos de proteínas del complejo de receptores de ligando en el programa LEAP y establezca ATP como ligando y EGFR como receptor. Establezca el valor de radio nacido generalizado en M Bond I2. A continuación, genere la topología Amber y los archivos de coordenadas para los archivos de Banco de datos de proteínas de fase gas.
Del mismo modo, para calcular las energías libres de unión entre las quinasas activadoras y receptoras de los EGFR de tipo salvaje y alanina 702 valina, especifique la quinasa receptora como ligando y la quinasa activadora como receptor y guarde la topología correspondiente y los archivos de coordenadas. Prepare un archivo de entrada de superficie de bornado generalizado de mecánica molecular y establezca el valor de IGB en dos y el salión en 0.1. A continuación, usando la mmpbsa.
py script disponible en Amber, ingrese el comando como se indica para ejecutar los cálculos de energía de enlace y analizar los datos de salida. Durante esta simulación representativa de 100 nanosegundos, el mutante de alanina 702 valina mostró una mayor estabilidad conformacional del segmento juxtmembrana B probablemente debido a interacciones hidrofóbicas más estrictas en comparación con el EGFR de tipo salvaje. El mutante de la valina alanina 702 también exhibió una menor energía libre de unión entre el activador y las quinasas del receptor en relación con el EGFR de tipo salvaje, lo que representa interacciones dimer más favorables que mantienen la conformación activa de la quinasa EGFR.
La simulación de la mutación de eliminación dio lugar a fluctuaciones de átomos C-alfa más bajas de la clave funcional alfa C-helix en comparación con el EGFR de tipo salvaje, prolongando el tiempo del estado activo EGFR. La mutación de la deleción también dio lugar a la formación frecuente de enlaces de hidrógeno entre los átomos polares de la cadena lateral de lisina 745 y glutamato 762, una interacción clave para la actividad enzimática de EGFR en comparación con el EGFR de tipo salvaje. Además, el número de enlaces de hidrógeno entre ATP y EGFR fue mayor para el mutante de eliminación que para el EGFR de tipo salvaje.
La mutación de la deleción también dio lugar a un movimiento hacia adentro del egFR estado inactivo alfa C-helix, un cambio estructural esperado durante la transición al estado activo. Por el contrario, la hélice C alfa de EGFR inactivo de tipo salvaje mantuvo su conformación inicial. Para evaluar el impacto de las mutaciones, es fundamental seleccionar los estados de conformación apropiados de las estructuras y preparar y equilibrar adecuadamente estas estructuras.
Es importante combinar simulaciones dinámicas moleculares con estudios experimentales, ya que la sinergia entre estas técnicas beneficia la interpretación de los resultados y puede informar a los experimentos de laboratorio húmedo adicionales.
