Este protocolo aborda algunos problemas clave existentes en la generación de organoides como la robustez y la confiabilidad, y pudimos aplicar estos organoides mejorados a la investigación innovadora sobre el envejecimiento neuronal. La heterogeneidad y la reproducibilidad son problemas importantes a la hora de generar organoides cerebrales corticales. Para superarlos, primero diferenciamos las hPSC en colonias neuroectodérmicas y luego en esferoides neuroepiteliales, que generan una arquitectura tisular reproducible.
Estos organoides cerebrales corticales comienzan a exhibir signos típicos de senescencia después de un cultivo in vitro prolongado, lo que los convierte en una plataforma útil para estudiar los procesos neuronales relacionados con el envejecimiento. Para comenzar, coloque las colonias de hPSC en una matriz de membrana basal calificada hESC de un pozo de una placa de seis pocillos al 60% de confluencia en tres pozos para lograr una densidad del 20 al 30% y luego proceda con la inducción de colonias neuroectodérmicas 2D. Agregue un medio N2 fresco suplementado con inhibidores duales de SMAD diariamente a cada pozo durante los próximos tres días.
Para generar esferoides neuroectodérmicos 3D a partir de colonias neuroectodérmicas 2D inducidas, retire dos mililitros de medio N2 de la placa de seis pocillos y lávese una vez con HBSS para asegurarse de que se elimine todo el medio N2. Agregue un mililitro de dispase a cada colonia que contenga bien. Incubar la placa durante 20 a 25 minutos a 37 grados centígrados y verificar el desprendimiento de colonias regularmente.
Al final de la incubación, para detener la actividad de la enzima dispasa, agregue un mililitro de medio N2 al pozo. Usando una punta de pipeta P1000 de diámetro ancho o una punta de pipeta P1000 modificada cortada con tijeras estériles, transfiera las colonias a un tubo de 15 mililitros y permita que los grupos de colonias se hundan hasta el fondo del tubo con gravedad. Luego, con una punta de pipeta P1000 estándar, retire cuidadosamente el sobrenadante.
Reemplácelo con un mililitro de medio N2 fresco y repita el lavado tres veces para garantizar la eliminación completa de la dispasa. Después de resuspender los grupos celulares y el medio N2, transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa de seis pocillos y agregue 40 nanogramos por mililitro de bFGF. Después de crioseccionar los organoides, retire el exceso de solución de montaje transfiriendo las diapositivas a un recipiente de tinción de diapositivas con una tapa y lave el tejido organoide seccionado tres veces con PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Luego incube los portaobjetos durante la noche a 37 grados Celsius con una solución de tinción de beta-galactosidasa recién hecha. Lave los tejidos teñidos tres veces con PBS durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente para eliminar la solución de beta-galactosidasa. Ahora monte los tejidos lavados con un soporte antifade de vidrio y permita que la solución de montaje se solidifique durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de verla bajo el microscopio.
Antes de la diferenciación neuroectodérmica, las colonias de hPSC mostraron una morfología monocapa plana apretada sin células diferenciadas que contaminaran las colonias. La expresión de NANOG también confirmó la pluripotencia de las colonias de hPSC. Después de la diferenciación de las colonias de hPSC en colonias neuroectodérmicas, se observó una morfología de forma columnal más larga, y fueron negativas para NANOG.
Después del tratamiento de dispasa y la exposición a FGF2 en el N2, las células madre neurales en estos esferoides proliferaron y formaron un número significativo de rosetas neurales que demostraron la polaridad apical-basal del esferoide mediante la expresión de Z01 en las células en el centro y el borde externo del esferoide. Una vez incrustado, el esferoide prolifera rápidamente y comienza a brotar, indicado por la presencia de los ganglios tisulares compactos y su expansión hacia afuera del cuerpo principal entre una y tres semanas, lo que se confirmó aún más mediante análisis cuantitativo y el diámetro del esferoide aumentó significativamente durante tres semanas. La tinción de inmunofluorescencia confirmó la presencia de células neuro progenitoras y marcadores de capa cortical en los organoides con capas claras, que fue observable en diferentes puntos de tiempo.
También se estudió el efecto de los procesos relacionados con el envejecimiento neuronal en el cerebro. Con el tiempo, se observó un aumento significativo en la presencia de senescencia asociada a beta-galactosidasa y en la semana 13, se detectó la presencia de p21, lo que indica senescencia. Es importante asegurarse de que se elimine todo el exceso de dispasa y que se separen suavemente y vuelvan a sembrar las colonias neuroectodérmicas intactas para formar esferoides sanos.
Esta plataforma de nuestra oportunidad única para estudiar la biología de un envejecimiento cerebral humano, también permite una investigación sobre el desarrollo crítico del cerebro, siempre que estos organoides se cultiven utilizando un biorreactor.
