El ACE es una mira de imagen óptima. Es compatible con repetirlo en imágenes in vivo a largo plazo de células de islotes con el fin de estudiar su función y viabilidad en una situación de injerto. También se puede extender para estudiar otros aspectos bajo condiciones fisiológicas y patológicas en tiempo real.
La ventaja de la técnica ACE radica en el hecho de que los mismos islotes pancreáticos humanos individuales pueden seguirse de forma no invasiva con resolución subcelular durante un largo período de tiempo. Las tasas de éxito de la terapia de reemplazo de células beta continúan mejorando. Sin embargo, la evaluación de la eficiencia del injerto de islotes y la supervivencia in vivo, sigue siendo difícil.
Este método podría ayudar a evaluar y optimizar los resultados de los trasplantes de islotes. Este enfoque no se limita únicamente a los islotes pancreáticos. También es adecuado para estudiar los tejidos afectados.
Por ejemplo, en complicaciones diabéticas, como glomérulos renales o piezas hepáticas, sólo para nombrar algunos. Para comenzar, coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento caliente colóquelo en el soporte de la cabeza y póngase la máscara nasal. Utilice el pulgar y el dedo índice para levantar ligeramente la cabeza.
Fijarlo con las piezas metálicas en los lados. Asegurarse de que las piezas de la oreja fijan la cabeza directamente debajo de las orejas. Inyecte por vía subcutánea la solución de buprenorfina en la parte posterior del ratón.
Retraiga suavemente los párpados del ojo para ser trasplantados usando fórceps contundentes. Saca el ojo y fíjelo libremente con un par de pinzas cubiertas con un tubo de polietileno. Después de transferir los párpados a un plato de Petri con PBS, recoja aproximadamente 20 a 30 islotes en el ojo cannular.
Usando un nivel de aguja de calibre 25 hacia arriba, inserte cuidadosamente la punta en la córnea y haga una sola incisión lateral. Levante cuidadosamente la córnea con la cánula precargada con islotes, y suelte lentamente los islotes en el ojo. Retraiga lentamente la cánula y aplique gel para los ojos en el ojo.
Después de 10 minutos, retire los fórceps, sosteniendo el párpado y vuelva a colocar el ojo en su posición normal. Para obtener imágenes de islotes humanos implantados con dos microscopía de fotones, coloque la plataforma del soporte de la cabeza bajo el microscopio y administre gel para los ojos en el ojo como líquido de inmersión entre la córnea y la lente. Coloque el ojo bajo el objetivo e imagine los islotes humanos implantados como se describe en el manuscrito del texto.
Para eliminar la autofluorescencia, vaya a la pestaña de procesamiento de imágenes, elija aritmética de canal y escriba el canal uno menos el canal dos. Esto crea un nuevo canal cuatro. Cámbiele el nombre a vasculature.
Repita este proceso y escriba el canal tres menos el canal dos para crear un nuevo canal cinco y cambiarle el nombre tomate todo. Para definir el islote, cree manualmente una nueva superficie y elija editar manualmente en el asistente. Mantenga el puntero en modo de selección y en vista 3D.
Y haga clic en el volumen para visualizar las secciones. En la ficha de dibujo, elija el contorno y haga clic en dibujar para empezar a dibujar contornos alrededor del borde del islote, comenzando en la posición del sector uno. A continuación, desplácese a una nueva posición de corte y repita los contornos de dibujo.
Termine con el último sector en la parte superior del islote y termine haciendo clic en la pestaña Crear superficie. Siguiente segmento, vasculatura de islotes y fluorescencia de tomate de islote usando máscara de islote. Elija el objeto de máscara de islote definido anteriormente, vaya a la pestaña de edición y haga clic en la pestaña máscara all, que abre una nueva ventana.
Elija el canal de vasculatura en el menú desplegable de selección de canales y active las opciones de canal duplicado antes de aplicar la máscara. Constante en el interior, exterior y establezca los voxels fuera de la superficie a 0.000 que crea un nuevo canal seis. Cambie el nombre de esta vasculatura de islote de canal.
Repita los pasos anteriores y elija el tomate todo en el menú desplegable de selección de canales, para crear el nuevo canal, cambiarle el nombre, tomate islote. A continuación, cree una nueva superficie en el menú de escena y elija la creación automática en el asistente. Establezca el canal de origen en la vasculatura de islote creada anteriormente y elija la resta de fondo.
Opcionalmente, utilice filtros. Por ejemplo, elija volume y ajuste el filtro en la ventana, que puede eliminar los objetos de servicio seleccionados. Finalice el asistente y asigne un nombre al nuevo objeto de superficie, vasculatura de islotes.
En el objeto de servicio vasculatura de islotes vaya a la pestaña de edición y haga clic en la pestaña máscara all, que abre una nueva ventana. Elija el canal de tomate de islote en el menú desplegable de selección de canales y establezca los voxels fuera de la superficie en 10.000, lo que crea un nuevo canal. Cambie el nombre de esta vasculatura de tomate de islote de canal.
Para segmentar la señal fluorescente de la cápsula de tomate, elija la aritmética del canal en la pestaña de procesamiento de imágenes y escriba el canal siete menos el canal ocho creando el nuevo canal. Renombrarlo cápsula de tomate. Cree una nueva superficie como se ha descrito anteriormente y elija canales de origen, vasculatura de tomate de islote o cápsula de tomate en el asistente.
A continuación, realice la resta de fondo. Abra el archivo de retrocayador de islotes y cree una nueva superficie. En el asistente, elija la creación automática y defina la región de interés.
Si es necesario, ajuste el umbral en intensidad absoluta. El objeto de superficie se puede hacer clic en o desactivar, para realizar una comprobación cruzada con la intensidad de canal correspondiente. Cuando haya terminado, cierre el asistente.
Por último, realice la cuantificación, seleccione un objeto de superficie creado en el menú de escena y vaya a la pestaña Estadísticas. Para recuperar datos de volumen detallados, elija la pestaña detallada y seleccione valores y volumen específicos en el menú desplegable. Para recuperar el valor total del volumen vaya a la pestaña detallada y elija los valores medios.
Este protocolo se utilizó para trasplantar islotes humanos no etiquetados en la cámara interior del ojo de ratones receptores fluorescentes rojos hembra de ocho semanas de edad. A continuación, se utilizó un software de imágenes interactivo para extraer datos cuantitativos de las imágenes. Imágenes de fluorescens in vivo, los injertos de islotes humanos se vio comprometido por interferencia significativa de la autofluorescencia de tejido que no se observó en injertos de islotes en ratones.
Para mejorar la relación señal/ruido, se restó el canal de autofluorescencia. A continuación, el límite del islote llamado máscara de islote y los canales correspondientes se definieron manualmente. Finalmente, la segmentación de la señal de tomate en la vasculatura del párpado y la cápsula del párpado y la representación superficial final se utilizó para extraer datos cuantitativos.
Aquí como una sesión de imagen longitudinal representativa del mismo injerto de islote humano a las dos semanas, dos meses, cinco meses y ocho meses después del trasplante. Se muestran imágenes MIP de datos sin procesar grabados originalmente, imágenes procesadas después de la eliminación automática de la autofluorescencia del islote y objetos de islot segmentados. Al realizar la inyección del párpado, asegúrese de precargar los islotes en un volumen pequeño y utilizar brazos flexibles de doble luz en el microscopio estéreo, para resaltar el espacio de la cámara ocular con el fin de inyectar con éxito los islotes en la AEC.
Después de la imagen in vivo, los ojos se pueden fijar e investigar más a fondo para detectar la tinción de anticuerpos y la histología convencional. Esta técnica es muy útil para estudios funcionales de islotes humanos individuales en tiempo real y en condiciones fisiológicas, especialmente en el contexto de la vascularización, viabilidad y estudios metabólicos.
