Este protocolo describe imágenes in vivo estabilizadas y repetitivas a nivel celular del páncreas con una nueva ventana de imágenes intravitales pancreáticas. La principal ventaja de esta técnica es que es posible realizar imágenes tridimensionales inmóviles con resolución hasta el nivel celular durante tres semanas en el páncreas de un ratón vivo. Comience por preparar la plataforma quirúrgica y desinfectar las superficies con etanol al 70%.
Después de la anestesia, use una sonda rectal con una almohadilla térmica homeotérmica controlada para controlar la temperatura corporal. Retire el vello del flanco izquierdo del ratón y aplique alcohol y yodo alternativamente, girando desde el sitio de la incisión hasta la superficie externa, nunca volviendo al sitio de la incisión y terminando con yodo. Luego, haga una incisión de 1,5 centímetros en el flanco izquierdo del ratón, diseccionando la piel y el músculo.
Use una sutura negra o de nylon 4-0 para realizar una sutura de cuerda de bolso en el margen de la incisión. Tire del bazo con cuidado con las pórceps anulares e identifique el páncreas. Colocando la ventana en el flanco del ratón, pase el bazo y el páncreas a través del espacio abierto de la ventana.
Luego, coloque suavemente el páncreas en la placa de la ventana de imágenes mientras coloca el bazo en el espacio abierto de la ventana. Inyecte PANC-1 nuclite rojo directamente en el páncreas. Use una aguja de catéter de calibre 31 para aplicar gotas de pegamento de cianoacrilato de n-butilo en el margen de la ventana de imágenes, asegurando que se aplique una cantidad mínima de pegamento.
Aplique suavemente un vidrio de cubierta redonda de 12 milímetros en el margen de la ventana de imágenes. Luego, sostenga el lazo de sutura para que quepa en la ranura lateral de la ventana y átelo tres veces. Finalmente, para evitar la interrupción de estos puntos apretados cuando los ratones están despiertos, corte el sitio proximal máximo de la corbata.
Comience encendiendo el microscopio intravital, incluida la potencia del láser. Para insertar un catéter vascular, aplique presión en el lado proximal de la cola con el dedo índice y el tercero. Si es necesario, caliente la cola con una lámpara.
Desinfecte la vena de la cola con un aerosol de etanol al 70%, luego inserte un catéter de calibre 30 en la vena lateral de la cola y visualice la regurgitación de sangre en el tubo DE PE-10. Aplique cinta de seda en el catéter para estabilizarlo. Inyecte dextrano FITC y dextrano TMR, u otras sondas fluorescentes según corresponda, de acuerdo con la combinación de sondas fluorescentes.
Inserte una sonda rectal para controlar automáticamente la temperatura corporal con un sistema de almohadilla térmica homeotérmica. Luego, inserte la ventana de imágenes pancreáticas preparada durante la configuración de la microscopía intravital en el soporte de la ventana. Transfiera el ratón de la plataforma quirúrgica a la etapa de imagen.
Para realizar imágenes intravitales, comience con imágenes del páncreas a un aumento bajo, como cuatro veces, para escanear toda la vista del páncreas en la ventana de imágenes pancreáticas. Una vez que se haya determinado la región de interés, cambie a una lente de objetivo de aumento más alto, como 20 veces o 40 veces, para realizar imágenes a nivel celular con resolución lateral y axial de aproximadamente 0,5 micrómetros y 3 micrómetros respectivamente. Realice imágenes de pila Z o de lapso de tiempo para observar la estructura 3D o la dinámica a nivel celular, como la migración celular.
La microscopía intravital combinada con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas proporciona estabilidad tisular a largo plazo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución para rastrear islotes individuales durante un máximo de tres semanas. La ventana implantada en un ratón C57 negro 6 N con anticuerpo anti-CD31 inyectado por vía intravenosa, conjugado con un fluoróforo Alexa 647, facilitó la obtención de imágenes de área amplia y magnificó las imágenes 3D del páncreas. Las células acinares se identificaron en las imágenes promediadas de tejido pancreático en la vasculatura adyacente, visualizadas utilizando autofluorescencia y anticuerpo anti-CD31 respectivamente.
Utilizando el método de imágenes en mosaico, que combina una vista de campo amplio con imágenes de alta resolución, se visualizaron aproximadamente de 40 a 50 islotes con la vasculatura adyacente en un ratón MIP-GFP. Un estudio anterior mostró que los islotes se pueden rastrear durante hasta tres semanas utilizando este método de imagen estable. Para visualizar las células cancerosas, los glóbulos rojos de nuclita PANC-1 se implantaron directamente en el páncreas del ratón durante la cirugía y los vasos cercanos se tiñeron con anti-CD31 conjugado con Alexa 647.
Usando este protocolo, se generaron imágenes de campo amplio de cáncer de páncreas. Esto ayudó a delinear el margen del tumor, así como a lograr imágenes 3D de alta resolución a nivel de una sola célula. El paso más crítico en este método es la hábil implantación de la ventana de imágenes pancreáticas en el ratón.
Usando otras combinaciones de células de ratón fluorescentes y sondas de anticuerpos, se pudo identificar la interacción dinámica de las células cercanas con los islotes o las células de cancelación. Este método puede ser ampliamente aplicado por aquellos que exploran el cambio del islote en diversas condiciones fisiopatológicas y microambientes del cáncer de páncreas in situ.
