Este novedoso protocolo describe el uso de múltiples secuencias distintas del ácido nucleico sintético imitan la gamma PNA para formar nanoestructuras en mezclas específicas de disolventes orgánicos. Los ensayos descritos aquí muestran la necesidad de adaptar los protocolos de nanotecnología de ácido nucleico existentes a disolventes orgánicos donde se han publicado pocos o ningún protocolo. A los practicantes nuevos en esta técnica les podría resultar difícil adaptar los protocolos existentes desarrollados para entornos ricos en acuos en entornos orgánicos ricos en disolventes debido a la propensión de la ANP de nanomaterial para agregar.
Comience preparando las existencias de gamma PNA. Después de obtener hilos de PNA gamma purificados de grado HPLC de un fabricante comercial, resuspendir cada hebra en agua desionizada a 300 concentraciones micromolares. Almacene los PNA gamma en menos 20 grados Centígrados durante un máximo de varios meses.
Cuando esté listo para realizar el autoensamble, prepare muestras de lotes recocidos en 75%DMSO, 75%DMF y 40%1, 4-dioxano. En primer lugar, preparar 20 substocks micromolares de cada oligómero mediante la alícuota de 0,67 microlitros de la población principal y la adición de agua desionizada para un volumen final de 10 microlitros. Agregue un microlitro de cada oligómero de los 20 substocks micromolares a un tubo PCR de 200 microlitros, que llegará a un volumen total de nueve microlitros para nueve oligómeros.
Agregue 30 microlitros de DMSO o DMF anhidros con un microlitro adicional de agua desionizada para un volumen final de 40 microlitros. Para preparar el lote 40%1, 4-dioxano, añadir 16 microlitros de 1, 4-dioxano y llevar el volumen a 40 microlitros con agua desionizada. Anneal las muestras durante 22,5 horas en un ciclor térmico de enfriamiento de 90 a 20 grados Celsius.
Típicamente, las temperaturas de fusión obtenidas para dos subconjuntos de PNA gamma oligómero y tres oligómeros se encuentran en el rango de 40 a 70 grados Celsius para diferentes condiciones de disolvente. Programe el ciclor térmico de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Una vez finalizada la recocido, las muestras se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante 12 a 24 horas antes de la caracterización.
Haga una cámara de humedad a partir de una caja de puntas de pipeta vacía llenando la caja con aproximadamente cinco mililitros de agua. Preparar una dilución de 20 veces de 2% de colodión disponible comercialmente en acetato de amilo con disolvente de acetato de isoamilo para crear la solución de nitrocelulosa. Utilice pinzas para sumergir un cubreobjetos en la solución de nitrocelulosa y permitir que se seque al aire, luego haga una cámara de flujo de un portaobjetos del microscopio, dos tiras de cinta de doble cara y la tapa recubierta de nitrocelulosa.
Preparar la solución de BSA de biotina pesando un miligramo de BSA de biotina y disolviéndola en un mililitro de PBS. Pipetear 15 microlitros de la BSA de biotina en el canal de flujo en ángulo e incubarlo durante dos a cuatro minutos a temperatura ambiente en la cámara humidificada. Soplar 15 microlitros del tampón de lavado, que consiste en un miligramo de BSA en un mililitro de PBS, en el canal para lavar el exceso de biotina BSA, luego pasivar la superficie incubando el canal de flujo durante dos a cuatro minutos en la cámara humidificada.
Mida 0,5 miligramos de estreptavidina y un miligramo de BSA, luego disuelva ambos en un mililitro de PBS. Pipetear 15 microlitros de la solución de estreptavidina en el canal de flujo y colocarlo en la cámara humidificada durante dos a cuatro minutos y lavar el canal mediante el flujo de 15 microlitros de tampón de lavado. A continuación, fluya 15 microlitros del lote recocido de oligómeros gamma PNA en la cámara humidificada, luego lave las nanoestructuras no enlazadas mediante el flujo de 15 microlitros de un Trolox milimotor en la misma composición solvente que las nanoestructuras.
Transfiera el canal de flujo al portaobjetos e újelo con un microscopio de fluorescencia equipado con imágenes TIRF, un objetivo de inmersión de aceite 60X y una lupa 1.5X. Escanee el canal de flujo con un aumento de 60 o 90X mientras supervisa el canal Cy3. Preparar 20 y 6%SDS stocks de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, luego recobrar los oligómeros gamma PNA añadiendo un microlitro de cada 20 oligómeros micromolares a un tubo PCR de 200 microlitros.
Añadir 30 microlitros de DMSO anhidro y un microlitro de 6%o 20%SDS a los tubos de PCR para un volumen final de 40 microlitros, lo que dará lugar a una concentración final de SDS de 5,25 o 17,5 militrolares respectivamente. Anneal los PNAs gamma en el termociclo como se describió anteriormente. Caracterizar las nanoestructuras gamma PNA en presencia de SDS utilizando el protocolo TIRF o TEM.
Las imágenes TIRF de oligómeros de PNA gamma recocidos en 75%DMSO mostraron arquitecturas bien organizadas mientras que el recocido en 75%DMF dio lugar a nanoestructuras en forma de espículo o en forma de aguja. La condición 40%1, 4-dioxano produjo una escasa decoración de nanoestructuras filamentosas. Además, las muestras de nanotubos gamma PNA formados en 75%DMSO demostraron la agrupación de nanofibras a alta ampliación o resoluciones nanoscópicas durante las imágenes TEM.
El análisis cuantitativo de la anchura de las nanoestructuras mostró una anchura media de 16,3 nanómetros con valores máximos superiores a 80 nanómetros. Los oligómeros de ADN isosecuentes que reemplazaron a los ANN gamma contiguos formaron estructuras filamentosas rectas, mientras que la sustitución de los ANN gamma cruzados dan como resultado estructuras estelares. Las nanoestructuras que fueron reemplazadas por oligómeros de ADN contiguos tenían anchos medios de alrededor de 19 nanómetros.
A altas concentraciones de SDS, las nanofibras gamma PNA también adoptan morfologías altamente en red en comparación con sus concentraciones críticas de micelas cuando se ven con imágenes TIRF. Las imágenes TEM indican que el ensamblaje de la ANP gamma en SDS de 5,25 mililitros tiene las reducciones más sustanciales en la agrupación estructural. Al intentar este protocolo, es importante recordar mantener las composiciones de disolvente como se mencionó debido a la propensión de las nanoestructuras a agregar.
Estos métodos alientan a los practicantes a buscar otras vías inexploradas de diferentes composiciones de disolventes, tensioactivos y otras nanoestructuras de ADN de ansancho.
