El protocolo presentado aquí disminuye el daño hipoxico excesivo durante la preparación de rebanadas de hipocampo de ratón adultos y envejecidos, eliminando así un obstáculo importante para estudiar la función de los circuitos neuronales maduros y envejecidos. La introducción de la hipotermia en soluciones libres de sodio da como resultado rebanadas hipocampales que son saludables hasta 10 horas después del corte y adecuadas tanto para las grabaciones de campo a largo plazo como para los estudios de sujeción de parches. Este método de preparación de rodajas de hipocampo podría ser particularmente relevante para modelos animales en enfermedades neurodegenerativas que por definición requieren una preparación cerebral envejecida.
El paso más crítico en este protocolo es introducir hipotermia a través de la profusión transcardial con una solución helada. Con un poco de práctica, los investigadores podrán ejecutar este paso de forma fiable. Comience preparando un litro de solución aCSF para la cámara de recuperación y las grabaciones posteriores.
A continuación, prepare 300 mililitros de NMDG-aCSF para la profusión transcardial y los pasos de corte. Coloque la bandeja de corte de microtoma vibratoria y el disco de montaje en un congelador de menos 20 grados Centígrados. Para preparar la cámara de recuperación, llénala justo por encima de la malla de sujeción de la rebanada e inicia el burbujeador manteniendo la cámara en el banco a temperatura ambiente.
Enfríe los 300 mililitros de NMDG-aCSF en un congelador hasta que los cristales de hielo comiencen a formarse en la superficie y las paredes de la botella. Coloque la botella con frío y NMDG-aCSF sobre hielo y burlíquela, manteniendo la solución entre cero y dos grados centígrados. Saque el disco de montaje de tejido del congelador y límpielo, si es necesario.
Corta un bloque de 5% de agar del tamaño de un cerebro de ratón y péguelo en el centro del disco usando una fina capa de pegamento de cianoacrilato. Coloque el disco con agar pegado sobre hielo y cúbralo con toallas de papel hasta que esté listo para usar. Saque la bandeja de corte del congelador, colóquela en el microtomo, luego rodeándola con hielo y cargue la cuchilla.
Prepare todas las herramientas con anticipación para la disección cerebral. Configure la bomba peristáltica para la perfusión transcardial. Inserte un lado del tubo de la bomba en la botella con NMDG-aCSF helado y ajuste el otro lado con una aguja de calibre 27.
Ajuste la velocidad de la bomba a aproximadamente 3,5 mililitros por minuto. A esta velocidad, la salida de un NMDG-aCSF es un viaje rápido, no un flujo continuo. Coloque el ratón sobre su espalda en un pañal.
Antes de continuar, confirmó que el ratón está en un plano quirúrgico de la anestesia mediante la realización de un pellizco del dedo del dedo del El ratón debe no responder, luego pegado por las patas delantera y trasera para que el pecho y el abdomen estén expuestos. Corta un gran parche de la piel en el pecho, yendo desde debajo del esternón hasta la garganta.
Agarre el esternón con fórceps, levántelo suavemente y comience a cortar a través de la caja torácica en ambos lados hasta que la cavidad torácica esté expuesta. Cortar a través del diafragma, dejando la solapa de la caja torácica unida a través de un pedazo delgado de músculo. Debe ser posible apartarlo sin que vuelva a caer sobre la cavidad torácica expuesta.
Compruebe que el corazón sigue latiendo y asegúrese de que la mayor parte del hígado es visible. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo, que se ve más claro en color que el derecho. Para estabilizar la aguja, conduzca a través de las costillas restantes en el lado izquierdo del cuerpo.
Localice la aurícula derecha de color rojo oscuro y córtela con tijeras pequeñas. La sangre debería empezar a fluir. Encienda la bomba y observe el hígado, que cambiará de color de rojo a marrón.
Monitoree el color del hígado y continúe con la perfusión hasta que el hígado se vuelva marrón pálido. Ejecute la bomba durante unos minutos más. La temperatura corporal del animal debe bajar a 28 a 29 grados Celsius y su nariz debe ser fría al tacto.
Decapita el ratón con tijeras de decapitación grandes, luego usa un bisturí con una hoja número 10 para abrir la piel en la parte superior del cráneo. Con pequeñas tijeras en ángulo, corta el cráneo en la línea media. A continuación, utilice el número tres fórceps para apartar las mitades derecha e izquierda del cráneo, teniendo cuidado de quitar la dura con él.
Retire el cerebro, que debe ser un color blanquecino sacándolo con una espátula y suéltelo en la solución NMDG-aCSF sobre hielo. Déjalo ahí hasta un minuto. Saque el cerebro del NMDG-aCSF y colóquelo en un pedazo de papel de filtro.
Corte y extraiga una cuña de tejido de 60 grados con una herramienta de 60 grados centrada en la línea media del extremo rostral del antebrazmo. Utilice los lados cortados de la superficie de montaje, ya que proporciona el ángulo adecuado para las rodajas de hipocampo. Separe los hemisferios por la línea media con el bisturí y péguelos en el disco de montaje.
Tome el disco de montaje del hielo y límpielo, si es necesario. A continuación, pegue cada hemisferio delante del bloque de agar, corte el lado hacia abajo. Asegúrese de que los lados ventrales de ambos hemisferios estén tocando el bloque de agar y que los lados dorsales de ambos hemisferios estén mirando hacia la hoja.
Cuando se pega en el lado de corte, cada hemisferio debe estar orientado en relación con la hoja de una manera que asegura las rodajas transversales del hipocampo dorsal in situ. Sumerja el disco con los hemisferios en una cámara de corte que contenga NMDG-aCSF carisfado con frío helado. Corte una sección de 400 micrómetros y, a continuación, utilice una pipeta de transferencia desechable con una punta de corte para transferir la rebanada a una cámara de recuperación que contenga NMDG-aCSF carbogenado a temperatura ambiente.
Continúe cortando el resto de las secciones y transfiriéndolas a la cámara de recuperación tomando no más de 10 minutos para cortar un total de ocho a 10 rodajas de la región dorsal del hipocampo. Incubar las rodajas a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas antes de la grabación. Este protocolo se utilizó para generar rebanadas de hipocampo a partir de ratones adultos.
Un gran número de células piramidales en el campo CA1 y el subiculum aparecen en bajo contraste, un sello distintivo de las células sanas, cuando se observan bajo microscopía de contraste diferencial infrarrojo. Las grabaciones de parches se pueden obtener de las neuronas CA1 de ratones de más de seis meses de edad. En el experimento de ejemplo aquí, la frecuencia de las corrientes postsinápticas excitatorias en miniatura se midió después de que NMDA-LTD fue inducido en relación con las condiciones de control.
La frecuencia de las corrientes postsinápticas excitatorias en miniatura fue menor en las neuronas después de una inducción NMDA-LTD, lo que indica la poda dependiente de la actividad de sinopsis en CA1. No se detectaron cambios en la amplitud. Durante las grabaciones de mEPSC, las células CA1 también se llenaron de biocytina y se puede ver aquí un árbol dendrítico intacto y un habitus celular saludable de las neuronas piramidales.
Una distribución robusta del tinte fluorescente a lo largo de la célula permite el análisis de dendritas y espinas dendríticas en diferentes condiciones. Se observó potenciación a largo plazo, o LTP, de sinapsis CA3-CA1 de aproximadamente 170%, lo que sugiere que el mantenimiento de las cascadas de señalización necesarias para el LTP está presente en rodajas preparadas a partir de ratones adultos. Una señal de potencial postsináptica excitatoria de campo robusto sugiere que también se conservó la conectividad de red.
Dos aspectos críticos del protocolo son la profusión transcardial con una solución helada para inducir hipotermia e introducción de un NMDG como sustituto del iones de sodio en soluciones para prevenir el edema citotóxico. Usando estas precauciones, se pueden preparar rodajas agudas desde cualquier región cerebral. Además, las rebanadas preparadas de esta manera se pueden utilizar para imágenes de calcio y voltaje utilizando microscopía de dos fotones o de campo ancho.
Este protocolo podría servir como base para una preparación estandarizada para las rebanadas agudas del hipocampo de animales envejecidos y así facilitar las comparaciones entre estudios en el contexto de mecanismos de enfermedad neurodegenerativa.
