Proponemos una nueva plataforma para investigar los efectos de la forma celular en la expresión génica, utilizando métodos para el cultivo y clasificación de adherencias con diferentes morfologías a nivel de célula única. La principal ventaja de esta técnica es que facilita el estudio de alto rendimiento de la forma celular in vitro ya que comparar células con diferentes formas in vivo es técnicamente exigente. Para establecer un cultivo de cardiomiocitos con patrones, transfiera una suspensión de cardiomiocitos en la relación de aspecto de interés a un tubo de 15 mililitros para contar y diluir las células a una de las 10 a las cinco células por mililitro de concentración media de chapado adecuada.
Añadir dos mililitros de células a un chip recubierto de fibronectina sumergido en dos mililitros de medio de chapado caliente dentro de un plato Grenier Petri de 35 mililitros y colocar el plato en una incubadora de 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 18 horas. Al día siguiente, revise el chip por microscopía de luz para confirmar que la mayoría de las células se han unido. Retire el medio del plato para eliminar los escombros y las células muertas, y comenzando desde el centro y moviéndose hacia los lados de una manera gota, agregue suavemente PBS a las células.
Después del tercer lavado, reemplace el PBS por un medio de mantenimiento de cuatro mililitros y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular. Después de 72 horas, enjuague suavemente la superficie de la viruta dos veces con dos mililitros de PBS caliente de Dulbecco caliente por lavado como se ha demostrado y utilice fórceps para transferir inmediatamente el chip lavado a un nuevo plato estéril Grenier Petri de 35 mililitros. Agregue rápidamente 1,5 microlitros de vibrante dicycle verde diluido 1000 veces en DPBS al chip.
Fije una cámara sobre el chip y coloque el plato en el porta platos de la etapa del recolector de celdas. Inserte la tapa magnética y localice la cruz en la ventana de vista en vivo. Concéntrese en el punto de mira y, en la ventana de escaneado y clasificación, seleccione la calibración para la inyección automática y calibrar.
Sustituya el sobrenadante de la antena parabólica con 1,5 mililitros de una solución de triple E en DPBS para aflojar las células de la fibronectina y abrir la pestaña de exploración. Para escanear todo el chip, concéntrese en la esquina superior izquierda del chip en el campo de visión y haga clic en Obtener la posición actual del microscopio. A continuación, concéntrese en la esquina inferior derecha del chip y haga clic en Obtener la posición actual del microscopio.
En la ventana emergente, haga clic en establecer el plano más nítido y haga clic en ir a la parte superior derecha y vaya a los botones de la esquina inferior izquierda. A continuación, haga clic en Finalizar para iniciar el análisis. Una vez finalizada la exploración, abra la pestaña de análisis y haga clic en Mostrar mapa para seleccionar las celdas individuales que superan los criterios de estudio.
Centrar el microcapilar de vidrio en el centro de la vista en vivo del microscopio y abrir la pestaña de la bomba. Para crear un vacío, retraiga el émbolo de una jeringa de 50 mililitros número uno cuatro mililitros y abra la pestaña de clasificación. Para permitir que se seleccione una sola celda, configure la válvula dos para que se abra durante 120 milisegundos y la válvula uno se abra durante 20 milisegundos después de un lapso de tiempo de 200 milisegundos.
Para permitir que la celda recogida se entregue correctamente a su tubo PCR que contiene el búfer de lesis, configure la válvula que se abrirá durante 20 milisegundos y la válvula dos se abra durante 10 milisegundos después de un lapso de tiempo de 10 milisegundos. Cuando se haya ajustado la configuración de la válvula, haga clic en calcular la ruta. El software calculará la ruta más rápida de celda en celda para recoger e inyectar las celdas seleccionadas en todo el chip.
A continuación, enfoca el microscopio en un patrón en la superficie de la viruta. Utilice el joystick para mover el microcapilar hacia abajo con cuidado para que se pueda obtener la imagen más nítida de la punta del microcapilar sin tocar la superficie del chip y hacer clic en el conjunto. Se abrirá una nueva ventana que muestra la sección transversal microcapilar.
Para que el software registre el desplazamiento de la punta del capilar en las coordenadas X, Y y Z, haga clic en el centro exacto del capilar. A continuación, haga clic en Iniciar ordenación para iniciar la ordenación. En este análisis representativo de ADNc preamplificado a partir de una sola célula escogida, se observó una banda clara en el gel como la gráfica de densitometría correspondiente al pico en 1,852 pares base en el electroferograma.
El tamaño promedio de los fragmentos era de 1.588 pares base con un pequeño número de fragmentos que eran menores que 300 pares base, lo que indica la generación de una buena biblioteca de ADNc. También se pueden realizar tinciones y análisis inmunofluorescentes para evaluar la estructura de sarcomere dentro de los cardiomiocitos modelados. Esta plataforma allana el camino para el estudio de alto rendimiento y el cribado de fármacos de diferentes tipos de insuficiencia cardíaca.
