Hücre şeklinin gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için, tek hücre düzeyinde farklı morfolojilere bağlılıkları büyütme ve sıralama yöntemlerini kullanarak yeni bir platform öneriyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücreleri in vivo'nun farklı şekillerle karşılaştırması teknik olarak zorlayıcı olduğu için hücre şeklinin in vitro olarak yüksek iş artışı çalışmasını kolaylaştırıyor olmasıdır. Desenli bir kardiyomiyosit kültürü kurmak için, sayma için 15 mililitrelik bir tüp ilgi en boy oranı bir kardiyomiyosit süspansiyon transfer ve bir kez 10 için bir kez seyreltilmiş uygun kaplama orta konsantrasyon mililitre başına beş hücre.
Bir fibronectin kaplı mikro desenli çip üzerine hücrelerin iki mililitre ekleyin sıcak kaplama orta iki mililitre içinde batırılmış 35 mililitre Grenier Petri çanak ve 18 saat boyunca 37 derece santigrat derece ve% 5 karbondioksit kuluçka çanak yerleştirin. Ertesi gün, hücrelerin çoğunun bağlı olduğunu doğrulamak için çipi ışık mikroskobuyla kontrol edin. Herhangi bir enkaz ve ya da ölü hücreleri kaldırmak için çanak orta çıkarın ve merkezinden başlayarak ve bir damla akıllıca bir şekilde yanlara doğru hareket, yavaşça hücrelere PBS ekleyin.
Üçüncü yıkamadan sonra, PBS'yi dört mililitrelik bakım ortamıyla değiştirin ve hücreleri hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. 72 saat sonra, yonga yüzeyini iki mililitre ılık Dulbecco'nun PBS'si ile iki kez yıkayın ve yıkanmış çipi hemen yeni bir steril 35 mililitrelik Grenier Petri kabına aktarmak için terlik kullanın. Çipe DPBS'de 1000 kat seyreltilmiş 1,5 mikrolitre canlı dcycle yeşil ekleyin.
Çip üzerinde bir oda sabitve hücre toplayıcı aşamasında çanak tutucu üzerine çanak yerleştirin. Manyetik kapağı takın ve çapraz işareti canlı görünüm penceresinde bulun. Artı işaretine odaklanın ve tarama ve sıralama penceresinde otomatik enjeksiyon için kalibrasyonu seçin ve kalibre edin.
Fibronektin hücreleri gevşetmek ve tarama sekmesini açmak için DPBS çözeltisinde bire bir üçlü E 1,5 mililitre ile çanak supernatant değiştirin. Tüm çipi tarayıp, görüş alanında çipin sol üst köşesine odaklanın ve geçerli mikroskop konumunu alın'ı tıklatın. Daha sonra, çipin sağ alt köşesine odaklanın ve geçerli mikroskop pozisyonunu alın'a tıklayın.
Açılır pencerede, en keskin düzlemi ayarla'yı tıklatın ve sağ üst köşeye gidin ve sol alt köşe düğmelerine gidin'i tıklatın. Ardından, taramaya başlamak için bitiş'i tıklatın. Tarama tamamlandığında, çözümleme sekmesini açın ve çalışma ölçütlerini geçen tek hücreleri seçmek için haritayı göster'i tıklatın.
Cam mikrokapilleri mikroskobun ortasında ki canlı görünümü ortalayın ve pompa sekmesini açın. Bir vakum oluşturmak için, 50 mililitrelik bir numaralı şırınga dört mililitre den piston geri çekin ve sıralama sekmesini açın. Tek bir hücrenin seçilebilmesi için, valfin ikisini 120 milisaniye, valfini ise 200 milisaniyelik bir zaman atlamadan sonra 20 milisaniye boyunca açılacak şekilde ayarlayın.
Seçilen hücrenin lysis tamponunu içeren PCR tüpüne başarıyla teslim edilebilmesi için, vanayı 20 milisaniye, valayı ise 10 milisaniyelik bir zaman atlamadan sonra 10 milisaniye boyunca açılacak şekilde ayarlayın. Valf ayarları ayarlandığında, yolu hesapla'yı tıklatın. Yazılım, seçilen hücreleri çip boyunca toplamak ve enjekte etmek için hücreden hücreye en hızlı yolu hesaplayacaktır.
Daha sonra mikroskobu çip yüzeyindeki bir desenüzerine odaklayın. Mikrokapillerin ucunun en keskin görüntüsünün talaş yüzeyine ve tıklatma setine dokunmadan elde edilebilmeleri için mikrokapilleri dikkatlice aşağı taşımak için joystick'i kullanın. Mikrokapiller kesiti gösteren yeni bir pencere açılacak.
Yazılımın X, Y ve Z koordinatlarında kılcal damarın uç ofsetini kaydetmesi için kılcal damarın tam merkezine tıklayın. Ardından, sıralamayı başlatmak için sıralamaya başlat'ı tıklatın. Seçilmiş tek bir hücreden önceden güçlendirilmiş cDNA'nın bu temsili analizinde, elektropherogramda 1, 852 baz çiftinin tepeye karşılık gelen densitometri çizimi gibi jelde açık bir bant gözlenmiştir.
Parçaların ortalama boyutu 1, 588 baz çifti ve 300 baz çiftinden daha kısa olan az sayıda parça, iyi bir cDNA kitaplığı neslini gösteriyordu. Desenli kardiyomiyositler içindeki sarcomere yapısını değerlendirmek için immünofloresan boyama ve analiz de yapılabilir. Bu platform kalp yetmezliği farklı türde yüksek iş artışı ve ilaç tarama için önünü açıyor.
