我々は、単一細胞レベルで異なる形態の付着を成長させ、選別する方法を用いて、細胞形状が遺伝子発現に及ぼす影響を調べるための新しいプラットフォームを提案する。この技術の主な利点は、生体内の異なる形状を持つ細胞を比較するのと同様に、インビトロで細胞形状のハイスループット研究を容易にする技術的に要求される。パターン化された心筋細胞培養を設定するには、目的のアスペクト比で心筋細胞懸濁液を計数用15ミリリットルチューブに移し、適切なめっき培地濃度の5ミリリットル当たり10倍の細胞に希釈する。
フィブロネクチンコーティングされたマイクロパターン化チップに2ミリリットルの細胞を加え、35ミリリットルのグレニエ・ペトリ皿の中に2ミリリットルの温かいめっき媒体に沈め、37°C、5%の二酸化炭素インキュベーターに18時間置きます。翌日、光顕微鏡でチップをチェックし、細胞のほとんどが取り付けられていることを確認します。皿から培地を取り出して破片や死んだ細胞を取り除き、中央から始めて左右に向かってドロップワイズで動き、PBSを細胞にそっと加えます。
3回目の洗浄後、PBSを4ミリリットル維持培地に交換し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。72時間後、示されているように、洗浄ごとに2ミリリットルの暖かいダルベッコのPBSでチップ表面を2回静かに洗い流し、鉗子を使用して洗浄されたチップを新しい滅菌35ミリリットルグレニエペトリ皿にすぐに移します。1.5マイクロリットルの鮮やかな二輪サイクルグリーン希釈1000倍のDPBSをチップに素早く加えます。
チップの上にチャンバーを固定し、セルピッカーステージの皿ホルダーに皿を置きます。磁気キャップを挿入し、ライブ ビュー ウィンドウで十字線を探します。十字線に焦点を当て、スキャンとソートウィンドウで、自動注入とキャリブレーションのキャリブレーションを選択します。
DPBS溶液中の1対1のトリプルEの1.5ミリリットルで皿上清を交換して、フィブロネクチンから細胞を緩め、スキャンタブを開きます。チップ全体をスキャンするには、視野内のチップの左上隅に焦点を合わせ、[現在の顕微鏡の位置を取得]をクリックします。次に、チップの右下隅に焦点を合わせ、現在の顕微鏡位置をクリックします。
ポップアップ ウィンドウで、[最も鮮明な平面を設定] をクリックし、右上に移動をクリックして、左下隅のボタンに移動します。次に、[完了] をクリックしてスキャンを開始します。スキャンが完了したら、[解析] タブを開き、[マップの表示] をクリックして、スタディ条件を満たす単一セルを選択します。
ガラスのマイクロキャピラリーを顕微鏡のライブビューの中央に中央に配置し、ポンプタブを開きます。真空を作成するには、プランジャーを50ミリリットルのナンバーワンシリンジ4ミリリットルから引き込み、ソートタブを開きます。単一のセルを選択できるようにするには、バルブ 2 を 120 ミリ秒、バルブ 1 を 200 ミリ秒のタイムラプスの後に 20 ミリ秒開くように設定します。
選択したセルをリシスバッファーを含む PCR チューブに正常に送達できるようにするには、バルブ 1 を 20 ミリ秒、バルブ 2 を 10 ミリ秒のタイムラプス後 10 ミリ秒で開くように設定します。バルブの設定が調整されたら、[パスの計算] をクリックします。ソフトウェアは、選択したセルをピックアップしてチップ全体に注入するためのセルからセルへの最速パスを計算します。
次に、チップ表面上のパターンに顕微鏡を焦点を合わせます。ジョイスティックを使用してマイクロキャピラリーを慎重に下に移動し、チップ表面に触れることなくマイクロキャピラリーの先端の最も鮮明な画像を得ることができるようにし、セットをクリックします。新しいウィンドウが開き、マイクロキャピラリー断面が表示されます。
ソフトウェアで、X、Y、Z 座標のキャピラリーの先端オフセットを記録するには、キャピラリーの正確な中心をクリックします。次に、[並べ替えの開始] をクリックして並べ替えを開始します。この一細胞から予増幅されたcDNAの代表的な分析では、ゲル状の密度測定プロットのような明確なバンドが、エレクトロヘログラムにおける1,852塩基対のピークに対応して観察された。
フラグメントの平均サイズは、300塩基対より短い少数のフラグメントを持つ1,588塩基対であり、良好なcDNAライブラリの生成を示す。免疫蛍光染色および分析は、パターン化された心筋細胞内のサルコメア構造を評価するためにも行うことができる。このプラットフォームは、さまざまなタイプの心不全のハイスループット研究と薬物スクリーニングへの道を開きます。
