Esta técnica permite el interrogatorio bioeléctrico intracelular con una resolución espacial extremadamente alta y especificidad celular utilizando sólo microscopía óptica estándar. Este método facilita la estimulación y el interrogatorio eléctrico de las células y ubicaciones específicas dentro de las células y se puede realizar in vitro, así como en preparaciones de tejido ex vivo 3D. Esta técnica permite la investigación biotécnica de muchas arenas celulares como células cardíacas o cerebrales, así como la comunicación eléctrica entre todas nuestras células no excitables.
Para aislar los miofibroblastos de una suspensión cardiomiocitos de miofibroblasto, pre-placa las células aisladas en una placa de cultivo de tejido de 100 milímetros durante una hora, ya que los cardiomiocitos necesitan una superficie de fibra cubierta y tratada para adherirse. Al final de la incubación, recoger el cardiomiocito enriquecido que contiene sobrenadante para el co-cultivo aguas abajo. Enjuague los miofibroblastos con DMEM para eliminar los cardiomiocitos restantes y alimentar las células con un medio de cultivo fresco antes de dos a cuatro días adicionales de incubación.
Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, utilice un escriba de diamante para cortar un chip de tres por tres milímetros de una oblea con nanohilos de silicio cultivados por deposición de vapor químico. Y usa fórceps afilados para enjuagar las virutas en 70%etanol. Después del enjuague, seque al aire las virutas durante 30 minutos bajo la luz ultravioleta en una campana de flujo laminar de biosegura, antes de transferir las virutas a un tubo de micro centrífuga estéril.
Utilice un enjuague completo del medio de cultivo celular para eliminar cualquier etanol restante, antes de sonicar las virutas en un mililitro de medio de cultivo fresco en un baño de sonicación durante uno a 10 minutos. El sobrenadante debe nublarse a medida que se liberan los nanohilos. Mezcle la suspensión de nanohilos de silicio en cinco mililitros de medio de cultivo fresco y sembrar la solución de nanoalimbramiento en el plato de los miofibroblastos.
Después de cuatro horas en la incubadora de cultivo celular, enjuague el plato cinco veces con un medio de cultivo fresco para eliminar los nanohilos noenterizados y continúe incubando las células durante otra hora para permitir que los nanohilos parcialmente internalizados se incorporen completamente. A continuación, agregue 500 microlitros de solución de recubrimiento de colágeno recién preparada a un plato inferior de vidrio de 35 milímetros. Después de una hora de incubación a 37 grados centígrados, enjuague el plato con PBS estéril y cosecha los híbridos de miofibroblast de nanocólica de silicio, con tres mililitros de trippsina, durante dos minutos a 37 grados centígrados.
Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con 10 mililitros de medio de cultivo, enjuague vigorosamente por pipeteo y no centrifugar más de 200 G para evitar dañar las células. Luego vuelva a suspender los pellets de células híbridas en un mililitro de medio fresco, y sembrar las células en el plato inferior de vidrio recubierto de colágeno. Para verificar la internalización del nanofondo, etiquete las células con citosol fluorescente y tintes de membrana, de acuerdo con los protocolos estándar, y utilice un microscopio confocal para tomar imágenes de las células.
Como los nanohilos de silicio son altamente reflectantes, se puede utilizar luz reflejada en lugar de fluorescencia para su visualización. Para establecer un co-cultivo de cardiomiocitos híbrido de nanohilo de silicio miofibroblasto, sembrar el número adecuado de cada tipo de célula en un plato inferior de vidrio recubierto de colágeno. Y cultivo de las células a 37 grados Celsius durante 48 horas, para permitir que las células formen uniones de brecha intercelular.
El día del experimento, reemplace el sobrenadante de cultivo por un mililitro de medio de cultivo complementado con un tinte sensible al calcio recién preparado, para una incubación de 20 a 30 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, lave la placa dos veces con PBS estéril, antes de tratar las células con un mililitro de DMEM libre de rojo fenol precalentó. Luego permita que el tinte de calcio intracelular se someta a des-esterificación durante 30 minutos a 37 grados Celsius, antes de adquirir imágenes basales.
Antes de la toma de imágenes ópticas y la estimulación, precalentar una micro-incubadora humidificada en un microscopio con una línea láser colimada acoplada en la trayectoria de la luz, para la toma de imágenes de calcio y la estimulación óptica a 37 grados Celsius y una mezcla de dióxido de carbono de la era de la burbuja del 5%. Cuando el microscopio esté listo, coloque el co-cultivo híbrido de miofibroblastos en la micro incubadora y visualice los nanohilos mediante microscopía de campo brillante para localizar un sitio de estimulación adecuado. Cuando se haya identificado un sitio, vuelva a configurar la trayectoria de la luz en el modo de fluorescencia, manteniendo el punto de estimulación en la ubicación predefinida del nanoeléducido, y valide la potencia de estimulación óptima y la longitud del pulso, para cada tamaño de nanohilo de silicio y tipo de célula.
Adquiera un registro de dos a diez segundos de la actividad basal de calcio intracelular, antes de estimular el nanoamátro con un solo pulso láser de uno a 10 melowatts de potencia y una duración de uno a 10 milisegundos, registrando la onda de calcio resultante durante otros dos a 10 segundos. Al final del experimento transfiera las películas grabadas de la estimulación óptica al programa de software adecuado, para un análisis adicional. Utilizando la óptica de contraste de fase estándar, las células de confluencia se ven fácilmente mediante microscopía de luz.
Los nanohilos de silicio, sin embargo, apenas son visibles, haciendo que sus ubicaciones sean imposibles de definir por este método. La super imposición de imágenes de campo claro y oscuro, sin embargo, permite la visualización de la disposición nuclear Perry de los nanohilos de silicio reflectante de luz. La microscopía confocal se puede utilizar para visualizar membranas de citosol y plasma manchadas por marcadores fluorescentes, haciendo que la ubicación intracelular de los nanohilos de silicio sea más evidente.
Usando la microscopía estándar, se puede obtener una imagen de campo brillante para identificar la ubicación del nanohilo de silicio que se va a estimular. A continuación, se puede obtener un breve vídeo de referencia de los cardiomiocitos que golpean espontáneamente y los miofibroblastos en reposo. Después de la estimulación, se puede registrar la propagación del calcio dentro del co-cultivo.
El tiempo en el que las diferentes células se excitan puede ser determinado por el punto en el que el cambio en el flujo óptico promedio alcanza su máximo. El flujo óptico se puede calcular para ayudar en la identificación del tiempo de activación dentro de cada región de celda. Las velocidades intracelulares se pueden determinar para cada célula utilizando gráficos de Khaimah, con la pendiente de la línea que representa la inversa de la velocidad de propagación intracelular.
Por ejemplo, aquí, se puede observar un resumen de las diferentes velocidades inter e intracelulares medidas para las interacciones celulares dentro de un único co-cultivo. Este método se puede utilizar para estudios in vivo inyectando la célula híbridos de silicio directamente en el tejido y utilizando preparaciones ex vivo 3D para estudiar la compañía eléctrica in vivo.
