Agradecemos a los miembros del laboratorio de Vijayanand por la ayuda técnica y las discusiones constructivas y al Dr. Sharron Squazzo y al Sr. Geoffrey Berguet de Diagenode por la asistencia técnica con el sonicador y la máquina y los protocolos de manejo de líquidos ChIP. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) y S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).

La Junta de Revisión Institucional (IRB) del Instituto la Jolla de Alergia e Inmunología (LJI; Protocolo IRB no. SGE-121-0714) aprobó el estudio. Se reclutaron voluntarios sanos y se les proporcionaron muestras de leucoféresis después del consentimiento informado por escrito.
1. Fijación celular
<ol><li>Llevar la concentración de suspensión celular a 1 a 2 x10 6 células/ml con medio de cultivo celular completo en un tubo de 15 ml (<10 ml de suspensión) o 50 ml de tubo (10-30 ml de células). Si <1 x 106 celdas, use 0.5 ml del medio en un tubo de 1.5 ml.</li>
	<li>Vórtice suavemente la suspensión celular, agregue 10x búfer de fijación de celdas hacia abajo (1:10; vol:vol) y gire a baja velocidad durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Detenga la reacción vórtice suavemente y agregue 2.5 M de glicina en la proporción de 1:20 (vol: vol). Invierta los tubos varias veces e incube en hielo durante al menos 5 minutos.</li>
	<li>Realice los pasos restantes a 4 °C o sobre hielo. Gire los tubos a 800 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet suavemente con 5 ml de PBS helado 1x e incube durante 2 minutos en hielo.</li>
	<li>Repita 1.4 y 1.5 con 1 ml de PBS 1x helado y transfiera la muestra a un tubo preenfriado de 1.5 ml (etiquetado para almacenamiento a largo plazo). Si procede, se recomienda la preparación de alícuotas.</li>
	<li>Gire los tubos a 1.200 x g a 4 °C y retire la mayor cantidad posible del sobrenadante sin alterar la bolita celular. Congele el pellet en nitrógeno líquido. Conservar a -80 °C. PRECAUCIÓN: Tome la protección adecuada cuando manipule nitrógeno líquido.</li>
</ol>2. Cizallamiento de cromatina
NOTA: Este protocolo está optimizado para el cizallamiento de cromatina de pellets con 0,3 a 3 x 106 celdas en tubos de baja unión de 0,65 ml.
<ol><li>Retire el tubo de muestras con gránulos de células congeladas de -80 °C y guárdelo sobre hielo seco para evitar cualquier descongelación del gránulo antes de agregar el tampón de lisis. Este paso es crítico.</li>
	<li>Agregue 70 μL de tampón de lisis completa RT fresco al pellet y manténgalo en RT durante 1 min.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet durante 1 minuto sin la introducción de burbujas y luego incube la suspensión celular en RT durante 1 minuto antes de poner la muestra en hielo.</li>
	<li>Transfiera el pellet resuspendido a un tubo de baja unión de 0,65 ml y manténgalo en hielo. NOTA: Para obtener una sonicación reproducible, precaliente el sonicador ejecutándolo solo con tubos en blanco durante 3-6 ciclos antes de sonicar las muestras.</li>
	<li>Coloque las muestras en el soporte del tubo del sonicador y llene los huecos con tubos de equilibrio llenos de 70 μL de agua. Deje las muestras en el baño de agua durante aproximadamente 1 minuto antes de comenzar la sonicación.</li>
	<li>Realizar sonicación para x ciclos (dependiendo del tipo de célula) con 16 s ON / 32 s OFF por ciclo. NOTA: Este paso requerirá experimentos de validación para determinar el número óptimo de ciclos para una sonicación eficiente.</li>
	<li>Después de cada 3 ciclos, retire las muestras del sonicador, gire suavemente el vórtice y el pulso los tubos antes de volver a colocarlos en el soporte. Asegúrese de que no haya pequeñas gotas en el exterior del tubo, ya que eso puede causar la formación de burbujas.</li>
	<li>Después de completar los ciclos necesarios, girar muestras a >14.000 x g durante 15 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de baja unión de 0,65 ml preenfriado y de baja unión y manténgalo en hielo.</li>
	<li>Desvincular una fracción de las muestras sonicadas para comprobar la eficiencia de la sonicación.<ol>
<li>Transfiera 1-7 μL del sobrenadante (equivalente a aproximadamente 250 ng de cromatina cortada) a un tubo de PCR de 0,2 ml y haga que el volumen sea de hasta 10 μL con tampón de lisis a corto plazo en RT.</li>
		<li>Añadir 1 μL de RNasa A e incubar durante 30 min a 37 °C a 800 rpm, luego añadir 1 μL de proteinasa K.</li>
		<li>Incubar durante 2 h a 55 °C con agitación a 1.000 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminar 2 μL de la muestra desenlazada para la cuantificación del ADN mediante el ensayo de cuantificación fluorescente10 (no se recomienda un espectrofotómetro ya que el jabón y la proteína degradada pueden producir sesgo en los resultados).</li>
	<li>Ejecute la muestra restante en un gel de agarosa al 1,2% durante 1 h a 70 V. Tinción con colorante de ácido nucleico (1:20.000) y lea el gel con un transiluminador UV.</li>
	<li>Preparar alícuotas de material de cromatina para su almacenamiento (diluir la muestra a 25 ng/μL en 20 μL con tampón de lisis completo). Conservar toda la cromatina cortada a -80 °C.</li>
</ol>3. ChIP-Seq automatizado para la modificación de histonas
NOTA: Este protocolo está diseñado para ejecutarse en un manipulador de líquidos ChIP. Aunque el sistema puede usar búferes personalizados, todos los búferes se proporcionan con el kit ChIP. Las tiras ChIP con 8 tubos utilizadas en esta sección son específicas para el manipulador de líquidos ChIP.
<ol><li>Transfiera 16 alícuotas de muestra con 500 ng de cromatina cortada en 20 μL desde -80 °C y colóquelas en hielo para descongelar lentamente la cromatina. Una vez descongelado por completo, vórtice brevemente y pulso-giro.</li>
	<li>Preparación de cromatina<ol>
<li>Pipete 100 μL de tampón tC1 suplementado con 1x inhibidor de la proteasa y 20 mM de butirato de sodio (tampón completo de tC1) en dos tiras de ChIP de 8 tubos.</li>
		<li>Transfiera 20 μL de cada muestra de cromatina a un tubo apropiado de las tiras de 8 tubos ChIP que contienen los 100 μL de tampón tC1 completo. Lave los tubos de cromatina agregando un tampón tC1 completo de 80 μL a los tubos de cromatina y luego transfiéralos de nuevo al tubo apropiado de las tiras de 8 tubos ChIP para un volumen final de 200 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación del anticuerpo<ol>
<li>Calcule el volumen de anticuerpos de tal manera que haya 0,5 μg de anticuerpos en cada tubo. Volumen de anticuerpo = ( númerode muestras x anticuerpo por reacción) / concentración de anticuerpos
</li>
		<li>Agregue la cantidad calculada de anticuerpos en 500 μL de tampón tBW1. Vórtice rápido y pulso-giro.</li>
		<li>Pipetear 70 μL de tBW1 en cada una de las dos tiras de 8 tubos ChIP y agregar 30 μL del anticuerpo + tBW1 a cada uno de los tubos. Esto llevará el volumen total en cada uno de los tubos a 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la cuenta magnética<ol>
<li>Vórtice la proteína A solución de perlas a fondo. Para 0,5 μg de anticuerpos, pipetee 5 μL de perlas en un nuevo conjunto de tiras de 8 tubos ChIP y espín de pulso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Llene la última fila del manipulador de líquidos ChIP con tiras de 8 tubos ChIP etiquetadas y vacías.</li>
	<li>Siga las especificaciones del programa ChIP-16-IPure-200D para la colocación de todas las tiras en la máquina manipuladora de líquidos ChIP. Agregue los búferes en la posición correcta, pero use tW4 en lugar del búfer tE1. NOTA: Organice el día de tal manera que el manipulador de líquidos ChIP realice el ChIP durante la noche. El programa se ejecutará durante aproximadamente 16 h para 16 muestras. Esto marca el final del Día 1.</li>
</ol>4. Integración de transposasas de adaptadores de biblioteca para la preparación de bibliotecas
<ol><li>Ajuste previamente un termomezclador a 37 °C y 500 rpm. Enfríe un imán para tiras de tubo de 0,2 ml sobre hielo.</li>
	<li>Para 16 muestras, prepare 440 μL de tampón de tagmentación en hielo. Pipetear 53 μL en una sola tira nueva de 8 tubos y mantener en hielo.</li>
	<li>En una nueva tira de 8 tubos de 0,2 ml, agregue 220 μL de tampón tC1 frío y manténgalo en hielo. Los tubos de 8 tiras pueden contener este volumen y aún así estar tapados.</li>
	<li>Retire el tubo de tira "MUESTRAS IP" de la máquina manipuladora de líquidos ChIP (fila 12) y tapone los tubos antes de girar por pulsos. Capture las perlas usando el imán para tiras de 8 tubos durante 2 minutos y retire cuidadosamente el sobrenadante.</li>
	<li>Transfiera 25 μL del tampón de tagmentación a las perlas con un multicanal, retire del imán y mezcle suavemente hasta que las perlas sean homogéneas (aproximadamente 5 veces hacia arriba y hacia abajo con la pipeta ajustada a 20 μL).</li>
	<li>Tapa los tubos y colócalos en el termomezclador precalentado e incuba durante 3 min. Aumentar el tiempo disminuirá la eficiencia de la preparación de la biblioteca.</li>
	<li>Transfiera los tubos a un estante de metal refrigerado y agregue un tampón tC1 refrigerado de 100 μL a cada muestra. Ajuste una pipeta multicanal a 80 μL y mezcle la muestra hasta que las perlas sean homogéneas, deteniendo la reacción de etiquetado.</li>
	<li>Vuelva a colocar las muestras en el manipulador de líquidos ChIP y continúe con el procedimiento de lavado Washing_for_IP-reacts_16_Ipure. Asegúrese de que el lavado se realice dos veces con tampón tC1 y dos veces con tW4. La elución debe completarse como lo marca el diseño del programa, con búfer tE1.</li>
	<li>Desenlace del ADN<ol>
<li>Retire las tiras de 8 tubos chIP en la última fila del manipulador de líquidos ChIP y agregue 2 μL RNasa A a cada muestra.</li>
		<li>Tapa los tubos, espín de pulso, mezcla suavemente las perlas con una pipeta multicanal hasta que la mezcla sea homogénea y vuelve a tapar los tubos.</li>
		<li>Incubar las muestras en un termomezclador durante 30 minutos a 37 °C y 900 rpm.</li>
		<li>Retire las muestras del termomezclador, agregue 2 μL de proteinasa K. Siga el mismo procedimiento que 4.9.2 después de la adición.</li>
		<li>Incubar las muestras en un termomezclador durante 4 h a 55 °C y 1.250 rpm, seguido de 65 °C a 1.000 rpm durante la noche. NOTA: Este es el final del Día 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Purificación de fragmentos de ADN etiquetados
<ol><li>Etiquete dieciséis tubos de 1,5 ml con el número de muestra apropiado y agregue 400 μL de tampón de unión al ADN del kit de limpieza de ADN a cada uno.</li>
	<li>Retire las tiras de 8 tubos del termomezclador y haga girar las tiras por pulsos para garantizar que se retenga cualquier producto evaporado. Coloque tiras en un imán de 8 tiras para capturar las cuentas.</li>
	<li>Transfiera 100 μL de ADN desenlazado a cada uno de los tubos de 1,5 ml. Agregue 100 μL del tampón de unión al ADN a las tiras de 8 tubos para lavar las perlas y luego transfiera al tubo apropiado de 1.5 ml.</li>
	<li>Vórtice durante unos 10 s y pulso-giro de los tubos de 1,5 ml.</li>
	<li>Cargue las columnas con los 600 μL que contienen el tampón de unión al ADN y la muestra ChIP.</li>
	<li>Girar muestras durante 20 s a 10.000 x g y volver a cargar la columna con el flow-through. Gira de nuevo con las mismas condiciones y descarta el flujo.</li>
	<li>Lave las columnas dos veces con un tampón de lavado de 200 μL (la misma centrifugación que el paso anterior) y deseche el flujo.</li>
	<li>Secar las columnas centrifugando durante 2 min a 12.000 x g.</li>
	<li>Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml y agregue 9 μL de TE Buffer caliente (precalentado a 55 °C) directamente a la matriz de columna. Deje que la columna se incube durante 1 min antes de la centrifugación durante 1 min a 10.000 x g.</li>
	<li>Transfiera los 9 μL del elutio a un nuevo conjunto apropiado de tiras de 8 tubos.</li>
	<li>Complete la elución nuevamente con 8 μL TE Buffer como antes. Transfiera el eluido a las tiras de 8 tubos apropiadas (volumen final 17 μL por muestra) y manténgalo en hielo.</li>
</ol>6. Amplificación y selección de tamaño de las muestras purificadas
<ol><li>Los siguientes pasos utilizan qPCR para determinar el número de ciclos necesarios para una amplificación óptima (determinación CtD – Ct)</li>
	<li>Prepare la mezcla de CtD para todas las muestras multiplicando el contenido del búfer de mezcla de CtD por el número de muestras.</li>
	<li>Dispensar 3,6 μL de mezcla de CtD en una placa qPCR y añadir 1,4 μL de muestras de ADN tagmentado (~10 % del volumen total). Realice la siguiente qPCR: 98 °C durante 3 min, 72 °C durante 5 min, 98 °C durante 30 s, 26 ciclos de 98 °C durante 10 s, 63 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s.</li>
	<li>Prepare la mezcla de amplificadores para todas las muestras multiplicando el contenido del búfer de mezcla de AMP por el número de muestras. Dispensar 14 μL de ADN marcado en pocillos separados de una placa de PCR, luego agregar 2,5 μL de dos cebadores de índice de secuenciación (25 μM) a cada muestra (el volumen de reacción final es de 50 μL).</li>
	<li>Mezclar las muestras mediante pipeta multicanal y realizar el programa de amplificación utilizado en el CtD con el número adecuado de ciclos. NOTA: Este es un buen punto de parada, ya que las muestras amplificadas se pueden almacenar a -20 ° C durante unas semanas. Sin embargo, la purificación se puede completar el mismo día. Para 48 muestras, los pasos 3 a 6.5 se completaron con otros dos lotes separados y luego se amplificaron en un lote como se describe a continuación.</li>
	<li>Realice la post-amplificación, la selección de tamaño y la cuantificación del ADN etiquetado como se describe a continuación. Esto generalmente se puede completar con 48 muestras (se puede completar con menos muestras según se desee).<ol>
<li>Agregue 90 μL de perlas paramagnéticas (proporción 1: 1.8) en cada pozo, mezcle y deje que se incube a RT durante 2 min.</li>
		<li>Captura las cuentas usando un imán de placa y desecha el sobrenadante. Lave las perlas 3 veces con 200 μL de etanol fresco al 80% sin interrumpir el pellet de perlas.</li>
		<li>Retire cualquier exceso de etanol con puntas de 20 μL después del lavado final y deje que las perlas se sequen durante 10 minutos o hasta que aparezcan grietas en los gránulos de perlas.</li>
		<li>Con la placa todavía en el imán, agregue 40 μL de agua precalentada a cada pozo. Selle la placa, vórtice a fondo y haga girar brevemente la placa por pulsos.</li>
		<li>Capture las perlas colocando la placa de nuevo en el imán y transfiera el elutio de 40 μL a una nueva placa de "muestra". Las muestras ahora están purificadas, y los siguientes pasos enriquecen fragmentos que van desde 200-1,000 pb.</li>
		<li>Paso de control de calidad opcional: Retire 4 μL de las muestras y transfiéralo a una placa de control de calidad. Añadir 4 μL de agua a las muestras. Esto determina el porcentaje de fragmentos grandes.</li>
		<li>Agregue 22 μL de perlas paramagnéticas (proporción 1:0.55) a las muestras, mezcle cuidadosamente e incube en RT durante 2 min.</li>
		<li>Coloque en el imán para capturar las cuentas durante 5 minutos y transfiera los sobrenadantes a las columnas 7-12 de la placa de "muestra". Retire la placa del imán y agregue 30 μL de cuentas (relación final de 1: 1.3). Mezcle con cuidado y deje que repose en RT durante 2 minutos.</li>
		<li>Captura las cuentas durante 5 minutos y luego descarta el sobrenadante.</li>
		<li>Lave todas las perlas 3 veces con 200 μL de etanol fresco al 80 % como se describió anteriormente (paso 6.6.2 – 6.6.3).</li>
		<li>Una vez que los gránulos estén secos, eluya el ADN con un tampón TE precalentado de 8 μL a cada pozo, mientras aún está en el imán.</li>
		<li>Retire la placa del imán, el sello y el vórtice a fondo. Deje que la placa se incube durante 2 minutos en RT, espín de pulso y vuelva a colocar la placa en el imán durante 2 minutos. Transfiera el sobrenadante a una placa nueva (Placa 2).</li>
		<li>Para una recuperación máxima, repita la elución con un extra de 8 μL de tampón TE precalentado. Coloque las muestras en los pozos apropiados de tal manera que cada muestra tenga 16 μL de biblioteca final. NOTA: Al final de este paso debe haber dos placas (una si no se completó ninguna placa de control de calidad). La placa QC tendrá los fragmentos pre-seleccionados y la segunda placa debe tener 48 pocillos de biblioteca final (16 μL en total).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Cuantificar las bibliotecas finales y las muestras de control de calidad utilizando un ensayo de fluorescencia
<ol><li>Cuantificación completa del ADN mediante un ensayo de cuantificación de fluorescencia o un método similar.</li>
	<li>Si se completó la cuantificación del control de calidad, determine el porcentaje de pérdida de muestra que se < 1.000 pb. No debería haber más de alrededor del 20% de pérdida; si hubiera más, podría haber un problema con las proporciones de cuentas aplicadas.</li>
	<li>Determinar el tamaño de los fragmentos de cada muestra, preferiblemente utilizando una máquina de electroforesis capilar. Para calcular la concentración molar utilice la siguiente ecuación: [Concentración de biblioteca (ng/μL) * 106]/[660 * Tamaño medio del fragmento (pb)]). NOTA: Las bibliotecas están listas para ser agrupadas (cantidades equimolares) y secuenciadas siguiendo los procedimientos estándar de secuenciación de próxima generación.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito aquí amplía el procedimiento de ChIPmentation11, que implementa un protocolo de preparación de la biblioteca de tagmentación antes de la purificación del ADN, mediante la automatización y microescala del protocolo. Desde el inicio de ChIP-Seq, el número de células requeridas se ha reducido drásticamente, de aproximadamente 20 millones de células para histonas a cientos e incluso células individuales1,7,10,12,18,19,20,21. Estos métodos recientemente desarrollados han permitido una comprensión más profunda de cómo los mecanismos cis-reguladores están funcionando en las células al aumentar la sensibilidad y permitir que se prueben poblaciones de células clínicas raras5,6,12,17. Por ejemplo, uno de los procedimientos más recientes y populares, llamado CUT&TAG, como alternativa ChIP-Seq robusta y sensible9. Produce una excelente relación señal-ruido ya que la enzima Tn5 se une covalentemente a la proteína A y reconoce la cadena Fc del anticuerpo ChIP con alta especificidad9. La actividad de fondo de la enzima Tn5 se reduce ya que la enzima no es funcional antes de unirse al anticuerpo objetivo9. Sin embargo, la implementación de este método en un contexto clínico es limitada, ya que requiere células vivas no fijas. Además, la eliminación de fragmentos de ADN del núcleo hipotónico podría tener efectos negativos en la cromatina a medida que se elimina durante el ensayo. El requisito necesario para trabajar con células frescas y vivas es una fuente de problemas para muestras clínicas raras y para grandes cohortes de muestras, ya que las cohortes grandes pueden tardar numerosos años en recolectar5. Otro tipo de método, drop-ChIP, utiliza elegantemente un dispositivo de microfluídica para generar etiquetas basadas en gotas antes de procesar el ChIP19. Sin embargo, utiliza un dispositivo microfluídico altamente especializado y, si bien es posible completar ChIP-Seq de una sola célula, también se limita al uso de células vivas7,8,9,18,19. Los métodos más nuevos que se basan en ChIP-Seq, como PLAC-Seq o HiChIP, intentan comprender las interacciones de 3 dimensiones (3D) entre los picos ChIP-Seq22,23. Estos métodos 3D son emocionantes, ya que están identificando interacciones cis-reguladoras o mediadas por TF en todo el genoma y una mejor comprensión de la regulación de la expresión génica en tipos celulares de interés, en tejidos sanos y en el contexto de la enfermedad.
Hay algunos pasos críticos a considerar para que el protocolo tenga éxito, como la calidad de la cromatina sonicada y la calidad del anticuerpo. La eficiencia de cizallamiento es crítica, si la cromatina no se sonica bien, la eficiencia del ensayo disminuye drásticamente24. La sonicación es un aspecto desafiante de ChIP-Seq debido a los números de celda requeridos. En el sonicador utilizado en el protocolo, la eficiencia se redujo drásticamente en menos de 300.000 células. Este es un aspecto desafiante en ChIP-Seq, ya que sonicar por debajo de ese nivel a menudo requeriría fragmentación enzimática, que es menos imparcial. Como resultado, la sonicación es un factor limitado importante para el verdadero ChIP-Seq a microescala. Otras plataformas de sonicación y kits disponibles comercialmente se probaron para sonicar la cromatina, pero el sonicador utilizado aquí tuvo los resultados más robustos y reproducibles. Otra ventaja del sonicador es no tener que comprar tubos especializados para ejecutar la sonicación, lo que reduce los costos cuando se trata de una gran cantidad de muestras. Para una sonicación óptima, en primer lugar, es importante precalentar el sonicador como se describió anteriormente. En segundo lugar, para lisar el pellet, se recomienda que la punta de la pipeta toque la parte inferior del tubo mientras se lisa para romper las células con más restricciones físicas. En tercer lugar, cualquier formación de burbujas antes de la sonicación dificulta la capacidad de la muestra para ser sonicada de manera uniforme. Si hay burbujas formadas durante la lisis, es importante eliminarlas con una pipeta. Esto puede ser un desafío sin eliminar una gran cantidad de muestra, pero si la punta se presiona ligeramente contra la burbuja, se puede extraer lentamente sin pérdida de mucha muestra. Por último, al determinar el número de ciclos, complete un curso de tiempo donde cada tres ciclos, la muestra se elimina, se purifica y se ejecuta en un gel de agarosa. Evite la sonicación excesiva / insuficiente de las muestras, ya que esto disminuye la eficiencia de ChIP. Si la muestra está subsónica, los fragmentos grandes pueden tener un efecto negativo en la calidad ChIP-Seq24. Por otro lado, si la muestra está sobresonada, existe el riesgo de que el epítopo objetivo se pierda en el proceso.
Otra parte esencial de ChIP-Seq es la calidad del anticuerpo. Antes de realizar cualquier estudio a gran escala, es necesario optimizar el anticuerpo que se utilizará. El objetivo es obtener una relación señal/ruido significativamente alta de las regiones conocidas del genoma y otra es la reproducibilidad. Si el anticuerpo está tirando de una gran cantidad de señal de fondo, se puede recomendar usar una entrada más grande o probar un lote / proveedor diferente. Esto agregará tiempo antes de comenzar un experimento a gran escala, pero es un paso esencial. Para detectar la señal a ruido, se recomienda usar qPCR con regiones que se sabe que son un objetivo de su anticuerpo y otra región que se sabe que está ausente. Se ha notado que las modificaciones de histonas son más robustas y fáciles de optimizar que las TF.
El protocolo descrito anteriormente proporciona un método robusto para la modificación de histonas de alto rendimiento ChIP-Seq de una manera semiautónoma y microescalada. El método limita la cantidad de tiempo práctico y aumenta la reproducibilidad sobre chIP-Seq manual. Estudios previos realizados en el laboratorio utilizaron ChIP manual sobre réplicas técnicas y obtuvieron una correlación de Spearman promedio de 0,505,sin embargo, con el sistema semiautomatizado, la correlación de Spearman entre diferentes donantes con un promedio de células NK de 0,66(Tabla suplementaria 2). Esto también se completó con aproximadamente un 40% menos de tiempo práctico. El método descrito aquí ha sido optimizado para modificaciones de histonas (H3K27ac se muestra aquí, pero el protocolo no debería necesitar ninguna modificación para otros) y solo requeriría modificaciones menores para ser implementado para TF ChIP-Seq. A pesar de la calidad del anticuerpo, la principal modificación sería para el tiempo de sonicación y potencialmente los buffers utilizados durante la IP. Por lo general, para los ensayos de TF ChIP, el método puede funcionar mejor con fragmentos ligeramente más largos de cromatina (con un rango de alrededor de 350-800 pb) ya que los complejos TF: DNA probablemente sean menos capaces de mantenerse a través de una sonicación rigurosa6. Es posible que los búferes también deban cambiar a una mezcla personalizada u otros kits disponibles en la industria, ya que los TF pueden comportarse de manera diferente a las modificaciones de histonas.
Aunque el manipulador de líquidos ChIP automatizado se probó para tan solo 10,000 células, hubo una disminución notable en la reproducibilidad a concentraciones más bajas de cromatina. Debido a esto, el protocolo no se recomendó a menos de 10,000 células, siendo 100,000 células las condiciones óptimas. El protocolo también se completó utilizando búferes ChIP de la industria, lo que fue un gasto adicional pero proporcionó datos de mayor calidad. El protocolo podría modificarse con respecto a las condiciones de sonicación (siempre que la cromatina cortada se mantenga dentro del mismo rango), los tampones podrían personalizarse para la inmunoprecipitación (IP; se puede requerir optimización) o no se puede usar el manipulador de líquidos ChIP. Una limitación del protocolo es el uso del manipulador de líquidos ChIP, que puede ser una inversión costosa y solo puede ejecutar 16 muestras a la vez. El manipulador de líquidos ChIP se limita a reacciones a pequeña escala y no se recomienda un número de células superior a un millón. Sin embargo, el protocolo podría completarse sin él, completando los pasos de IP y lavado manualmente. Si la IP y los lavados se completaron a mano, el tiempo para completar el ensayo aumentará y la reproducibilidad puede disminuir, pero esta guía seguirá siendo útil para ejecutar un experimento ChIP-Seq de alta calidad. Cabe destacar que otros manipuladores de líquidos podrían adaptarse para ejecutar reacciones ChIP semiautomatizadas.
En resumen, los principales beneficios de este sistema es la naturaleza de alto rendimiento, ya que los pasos de IP y lavado se completan de forma autónoma. Como tal, se pueden completar rondas secuenciales de experimentos ChIP, lo que permite que hasta 48 muestras se procesen completamente y estén listas para la secuenciación en 5 días, con un tiempo práctico limitado en comparación con los experimentos manuales ChIP-Seq. Otro beneficio es el aumento de la reproducibilidad ya que ChIP-Seq puede ser difícil de obtener resultados altamente reproducibles. Otros métodos requieren células vivas, sistemas complejos de microcantilización o que el trabajo se complete a mano. Este sistema tendrá que ser optimizado para muestras de baja entrada (<10.000 células), permitiendo en última instancia reacciones ChIP de una sola célula. El sistema también es capaz de ser adaptado para los nuevos métodos ChIP, como PLAC-Seq y HiChIP22,23.

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Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

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Sara Herrera-de la Mata

El amplio uso de ensayos ChIP-Seq para determinar fragmentos de ADN asociados con modificaciones específicas de histonas se debe en parte a su capacidad para identificar elementos de ADN cis-reguladores, incluidos potenciadores activos, promotores, silenciadores, heterocromatina y otros1,2,3,4. La identificación de regiones reguladoras no codificantes en todo el genoma ha demostrado una valiosa información para comprender mejor la regulación génica en la salud y las enfermedades4. Trabajos previos del laboratorio han utilizado ChIP-Seq para demostrar que los elementos cis-reguladores pueden desempeñar un papel importante en diferentes tipos de células5. Los ensayos chIP del factor de transcripción (TF) se han utilizado para mostrar polimorfismos de un solo nucleótido de riesgo asociado a la enfermedad6.
El uso de ChIP-Seq con muestras clínicas humanas es un desafío, principalmente debido a la limitación del número de células o la muestra de tejido deseada. Como resultado, ha habido un esfuerzo concertado en el campo para mejorar y microescalar estas técnicas y, como resultado, han surgido varios ensayos, como CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12. Este ensayo utiliza una transposasa para etiquetar y aislar regiones genómicas unidas por un anticuerpo específico9. Esta técnica ha sido capaz de reducir el número de células a 1.000s y en algunos casos a una sola célula, sin embargo, el uso de esta técnica en la investigación traslacional y la configuración clínica ha mostrado limitaciones debido a los requisitos de uso de células vivas para este método9,12. El requisito de células vivas hace que las muestras clínicas sean logísticamente difíciles de manejar y puede introducir efectos de lote si las muestras no se procesan al mismo tiempo. Otros han optimizado las técnicas a microescala para células fijas de formaldehído, incluido el desarrollo de ChIPmentation11,que se adapta aquí de una manera de alto rendimiento. El uso de celdas fijas permite almacenar muestras hasta la recolección y el posterior procesamiento de todas las muestras juntas para minimizar los efectos por lotes.
Aquí, se describe un ensayo ChIP-Seq microescalado semiautomatizado que reduce el tiempo práctico experimental para perfilar las modificaciones de histonas10. El método semiautomatizado permite ensayos ChIP-Seq de alto rendimiento, lo que permite que hasta 48 muestras se procesen completamente y estén listas para su secuenciación en tan solo 5 días, para tan solo 10,000 células por muestra utilizando un manipulador de líquidos ChIP. El manipulador completa la inmunoprecipitación (IP) y los lavados posteriores de forma autónoma, lo que ayuda a reducir la variabilidad entre muestras. El método semiautomatizado reduce tanto el tiempo práctico en más de 15 h para 48 muestras como la variabilidad técnica, lo que permite realizar estudios epigenéticos a gran escala de manera reproducible y rápida para células primarias o cultivadas. El protocolo explica el proceso de principio a fin para ChIP-Seq de alta calidad. Si las máquinas específicas no están disponibles, el protocolo seguirá siendo un recurso útil para configurar y solucionar problemas de los experimentos ChIP-Seq manualmente.
El ensayo se realizó con tres tipos diferentes de células inmunes humanas primarias y una línea celular cultivada (HUT78 – ATCC: TIB-161). Para mayor claridad, el protocolo se ha dividido en siete secciones: fijación celular, cizallamiento de cromatina a través de sonicación, inmunoprecipitación automatizada de cromatina, preparación de bibliotecas por tagmentación de fragmentos de ADN, amplificación de bibliotecas, purificación de bibliotecas, seguida de cuantificación de ADN. Para obtener recetas de tampón, consulte la Tabla suplementaria 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="950">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">200 &#181;l tube strips (8 tubes/strip) + cap strips</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020002</td>
			<td style="width:288px;">Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">AMPure XP for PCR Purification</td>
			<td style="width:127px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>SPRI beads</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-060-C</td>
			<td>0.65 mL low binding tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Bioruptor Pico Sonicator</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B01060010</td>
			<td>Sonicator used in the lab but others can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ChIP DNA Clean &#38; Concentrator (Capped Columns)</td>
			<td style="width:127px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D5205</td>
			<td>DNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA pH 8.0</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">2231000667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Glycine</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">50046-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">H3K27ac polyclonal antibody - Premium</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15410196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES (1 M) pH 7.5</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20027213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20034197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IP-Star Compact Automated System</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B03000002</td>
			<td>Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">KK2601</td>
			<td>PCR mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">R0971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4551-250ML</td>
			<td>CAUTION - low flash point</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (5 M), RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-4700</td>
			<td style="width:288px;">8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PureLink RNase A (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td>Used in the flourescence quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">4485699</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ROX Reference Dye</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12223012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">303410-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S11494</td>
			<td>nucleic acid dye</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Tips (bulk)</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30040020</td>
			<td>Tips for the IP Star</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">True MicroChIP Kit</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C01010130</td>
			<td>Contains all the buffers for the IP; ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24730020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies

La inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación (ChIP-Seq) es un enfoque poderoso y ampliamente utilizado para perfilar el ADN de cromatina asociado con modificaciones específicas de histonas, como H3K27ac, para ayudar a identificar elementos de ADN cis-reguladores. El proceso manual para completar un ChIP-Seq requiere mucha mano de obra, es técnicamente desafiante y, a menudo, requiere números de células grandes (>100,000 células). El método descrito aquí ayuda a superar esos desafíos. Se describe en detalle un procedimiento completo semiautomatizado y microescalado H3K27ac ChIP-Seq que incluye fijación celular, cizallamiento de cromatina, inmunoprecipitación y preparación de la biblioteca de secuenciación, para lotes de 48 muestras para entradas de número celular inferiores a 100,000 células. La plataforma semiautónoma reduce la variabilidad técnica, mejora las relaciones señal-ruido y reduce drásticamente la mano de obra. De este modo, el sistema puede reducir los costos al permitir volúmenes de reacción reducidos, limitando el número de reactivos costosos como enzimas, perlas magnéticas, anticuerpos y tiempo práctico requerido. Estas mejoras en el método ChIP-Seq se adaptan perfectamente a los estudios epigenéticos a gran escala de muestras clínicas con un número limitado de células de una manera altamente reproducible.

Como prueba de concepto, ChIP-Seq se completó para seis donantes humanos con tres conjuntos de tipos de células inmunes: células T CD4 ingenuas (CD4), monocitos clásicos (MO) y células asesinas naturales (NK), enriquecidas por clasificación FACS como se describió antes13. El procedimiento subrayado consta de nueve procedimientos distintos como se representa en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig1.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo general para el procedimiento. (A) Una caricatura del procedimiento general (generado en BioRender). (B) Diagrama de flujo para todos los pasos principales para el protocolo y el tiempo práctico y total estimado asociado con cada día. La secuenciación podría ocurrir al final del Día 5 o más tarde con múltiples rondas. La línea de tiempo también se puede escalonar a lo largo de la semana, donde los días secuenciales 3-4 se pueden completar varias veces en una semana para generar 48 muestras de ChIP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Después del aislamiento celular por citometría de flujo13,las células clasificadas se centrifugaron y las células se fijaron y almacenaron como se describió anteriormente. Una vez que se recogieron todas las muestras, las muestras se lisaron y prepararon para el cizallamiento cromático en lotes de 12 como se describió anteriormente. Para cada muestra, se completó el número de ciclos para alcanzar la sonicación óptima10. La medición cuantitativa, así como las mediciones del tamaño del fragmento de cromatina cortada mostraron una gran reproducibilidad de nuestro método en los tres conjuntos de células inmunes(Figura 2A). Las diferentes células inmunes humanas se sonicaron en lotes separados y rindieron de manera muy consistente con > el 70% de la muestra entre 100 y 500 pb durante 14 ciclos (16 s ON, 32 s OFF por ciclo). En este punto, las muestras con fragmentos grandes después de la sonicación (< el 70% de la muestra entre 100 - 500 pb) se consideraron fallidas. Estas muestras podrían sonicarse durante 1-2 ciclos adicionales o fueron descartadas y reemplazadas más tarde con células de otro pellet. Nuestro método mostró que ninguna de las muestras requirió más sonicación o fue eliminada, lo que sugiere una robustez absoluta del procedimiento.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig2.jpg"> Figura 2: Ejemplos de control de calidad de presecuenciación. (A) Los geles de agarosa al 1,2% muestran reproducibilidad de la sonicación. Muestras de sonicación para 6 donantes en tres tipos de células: células T CD4 ingenuas (CD4), monocitos clásicos (MO) y células asesinas naturales (NK). Las muestras fueron sonicadas durante 14 ciclos (16 s ON, 32 s OFF por ciclo). Para cada muestra, se cargaron alrededor de 200 ng de cromatina desenlazada en un gel de agarosa al 1%. Las muestras se consideraron buenas si más del 70 % de los fragmentos están dentro de 100-500 pb. (B) Top - Análisis de curvas de amplificación qPCR para determinar el número óptimo de ciclos para la amplificación (Ct donde hay 1/2 de la intensidad máxima). Las muestras ideales tienen un Ct de aproximadamente 15 y la amplificación se puede completar hasta 2 ciclos más del Ct medido. La flecha es un ejemplo de un mal ejemplo donde el Ct es mayor que 18. Abajo - Se muestra un ejemplo de un conjunto pobre de muestras que tienen un Ct mayor que 18. Estas muestras también mostraron una menor intensidad de fluorescencia. (C) Izquierda - Los rastros de electroforesis del analizador de fragmentos mostraron la distribución de las bibliotecas etiquetadas finales después de la amplificación y la selección de tamaño. Las muestras con más del 85 % de la biblioteca de fragmentos dentro de 200-1.000 pb se consideraron como buenas muestras. La medición de la intensidad máxima de la fluorescencia también se considera un parámetro importante de control de calidad, de hecho, si la señal es baja, es poco probable que la muestra se secuencia bien. Derecha: se muestran ejemplos de muestras positivas en CD4, MO y NK. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Después de la cuantificación, las muestras se ejecutaron en un manipulador de líquidos ChIP con anticuerpos H3K27ac, seguido de la etiquetación con la enzima transposasa Tn5. Para determinar el número apropiado de ciclos de amplificación por qPCR, se utilizó el 10% de las muestras etiquetadas. Para la determinación del número de ciclos para la amplificación de las muestras, encontramos el ciclo en el que la intensidad de la muestra es la mitad del máximo promedio para la determinación del ciclo (Figura 2B). Las muestras con valores de Ct de más de 18 no tuvieron un buen desempeño después de la secuenciación y, por lo tanto, su valor de Ct fue indicativo de una muestra de ChIP fallida. Estas muestras generalmente también produjeron una menor cantidad de ADN después de la amplificación. Las muestras (entrada de 100.000 células) con un valor de Ct igual o inferior a 15 fueron ideales y las muestras entre 15 y 18 fueron aceptables pero menos consistentes después de la secuenciación. Para muestras con menos de 100,000 celdas de entrada, los valores de Ct generalmente se encontraron entre 15 y 18, pero no necesitaron más de 18 ciclos para producir suficiente producto para la secuenciación.
Después de la amplificación del ADN etiquetado, las bibliotecas se purificaron y seleccionaron el tamaño para obtener una distribución de tamaño ideal, que oscilaba entre 200 y 1.000 pb, para la secuenciación NextGen. La evaluación de la distribución del tamaño en cada una de las bibliotecas se completó porque se obtuvieron los mejores datos de secuenciación cuando más del 85% de los fragmentos de ADN oscilaban entre 200 y 1.000 pb(Figura 2C). En particular, a medida que se cargaba la misma cantidad de ADN (medida por cuantificación de fluorescencia), se notó que las muestras con menor intensidad de fluorescencia generalmente se secuenciaban mal(Figura 2C).
Post secuenciación, se aplicaron controles de calidad estándar basados en las directrices ENCODE ChIP-Seq5,14,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig3.jpg"> Figura 3: Reproducibilidad de las muestras de células inmunes. (A) H3K27ac rastrea (UCSC Genome Browser, intensidad máxima, función de suavizado de 4, todos con eje Y igualmente escalado) para 6 donantes (100,000 células por réplica) en cada tipo de célula (CD4, MO y NK). Se muestran cuatro loci ejemplares, dos con (locus IL2RA y PTPRC) y dos sin enriquecimiento para H3K27ac (CCR4 y MS4A1). (B) La correlación de Pearson entre los donantes y las gráficas de correlación correspondientes generadas utilizando una extensión de 300 pb y una ventana de 500 pb dentro del paquete MEDIPS para cada uno de los tipos de célula replica16. (C) Archivos de donantes fusionados para cada tipo de célula que muestran pistas H3K27ac (intensidad máxima del UCSC Genome Browser, función de suavizado de 4) en regiones específicas del tipo de célula (IL17R para CD4, CCR2 para MO y KLRC1 para NK) y el gen de mantenimiento doméstico B2M, presente en todos los tipos de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para el control de calidad visual, se prepararon pistas de enriquecimiento H3K27ac para su visualización en el navegador del genoma UCSC. Para cuatro loci genéticos, las pistas individuales para cada muestra mostraron una alta calidad de mapeo y una relación señal-ruido que refleja la alta consistencia y robustez de nuestro ensayo(Figura 3A). Los dos loci a la izquierda albergan genes bien expresados en estos tipos de células, mientras que los genes en los dos loci a la derecha no se expresan y sirven como controles de fondo13 (Figura 3A). Además, se utilizó el paquete de análisis MEDIPS como variable post-secuenciación para evaluar el índice de correlación entre réplicas técnicas(Figura 3B)5,16,17,estableciendo el grado de correlación para lecturas de nivel de enriquecimiento para contenedores de 500 pb16. Para la mayoría de las comparaciones por pares, los índices de correlaciones de Pearson mostraron una correlación de más del 90%, lo que sugiere un alto nivel de consistencia entre las réplicas biológicas(Figura 3B). Las réplicas con correlación aceptable se fusionaron para aumentar la relación señal-ruido. Mientras que los loci específicos del tipo celular mostraron un alto enriquecimiento en las células apropiadas, un gen de mantenimiento doméstico (B2M) mostró una modificación de histonas muy consistente(Figura 3C). Para el análisis, la fusión de pistas de réplicas aumentará el enriquecimiento, reforzará la señal específica, incluso para importantes potenciadores específicos del tipo de célula, y reducirá la variabilidad interindividual inherente a las muestras humanas5.
Aunque se utilizaron 100,000 células para este estudio, hubo una alta reproducibilidad para tan solo 10,000 células en una línea de células T cultivadas en humanos (HUT78). El análisis de correlación entre el conjunto de datos ChIP-Seq realizado a partir de muestras con menos de 100.000 células mostró una alta reproducibilidad y correlación hasta 10.000 células(Figura 4A).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig4.jpg"> Figura 4: Reproducibilidad de muestras de baja entrada. (A) Ejemplos de la consistencia de H3K27ac ChIP-Seq para células 100,000 hasta 10,000 en células HUT-78 (una línea celular de linfoma de células T). Las pistas (UCSC Genome Browser, intensidad máxima, función de suavizado de 4, todas con eje Y igualmente escalado) muestran el locus IL4. (B) Correlaciones de Pearson de las réplicas utilizando una extensión de 300 pb y una ventana de 500 pb dentro del paquete MEDIPS16.  (C) Correlaciones de Pearson entre los diferentes grupos de números celulares (100.000, 50.000 y 10.000 células) utilizando los mismos parámetros MEDIPS que en (B)16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El análisis de correlación de Pearson mostró un alto índice de correlación (83% a 92%), lo que sugiere el mantenimiento de la señal en muestras de bajo número de células. Sin embargo, hubo un aumento de fondo a medida que se redujeron los números de células, así como una disminución de los coeficientes de correlación(Figura 4B). Para mantener señales de fondo bajas, se fusionaron duplicados técnicos y se probó la correlación entre grupos(Figura 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Búfer de fijación de celdas 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Compuesto</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución de formaldehído</td>
			<td>11%</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>100 metros</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA, pH 8.0</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES, pH 7.5</td>
			<td>50 metros</td>
		</tr>
<tr>
<td>Búfer de lisis completo</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Compuesto</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>50 metros</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Butirato de sodio</td>
			<td>20 metros</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cóctel inhibidor de la proteasa</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampón de lisis a corto plazo</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Compuesto</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>50 metros</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mezcla de tagmentación</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Compuesto</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>N,N-dimetilformamida</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzima de tagmentación Illumina</td>
			<td>1:24 vol:vol</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mezcla de CtD</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Compuesto</td>
			<td>Por muestra (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NextEra Índice Primer A (25 μM)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>NextEra Índice Primer B (25 μM)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td>
			<td>2.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>1:1000 SYBR Tinte verde</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinte pasivo ROX</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua</td>
			<td>Relleno a 4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mezcla amp</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Compuesto</td>
			<td>Por muestra (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td>
			<td>27.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua</td>
			<td>Llenar a 31 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla suplementaria 1: Recetas tampón. 
Tabla suplementaria 2: Correlaciones de muestras de Spearman y Pearson para los 6 donantes y cada tipo de célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/Supplementary_Table_2.xlsx">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

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A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Este artículo describe un protocolo ChIP-Seq semiautomatizado y microescalado de regiones de ADN asociadas con una modificación específica de histonas (H3K27ac) utilizando una plataforma de manejo de líquidos ChIP, seguida de la preparación de la biblioteca mediante tagmentación. El procedimiento incluye la evaluación de control con fines de calidad y cantidad y puede adoptarse para otras modificaciones de histonas o factores de transcripción.

Un procedimiento ChIP-Seq semiautomatizado para estudios epigenéticos a gran escala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

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Research

JoVE Journal

Biology

3.2K vistas.  La Jolla Institute for Immunology. Este artículo describe un protocolo ChIP-Seq semiautomatizado y microescalado de regiones de ADN asociadas con una modificación específica de histonas (H3K27ac) utilizando una plataforma de manejo de líquidos ChIP, seguida de la preparación de la biblioteca mediante tagmentación. El procedimiento incluye la evaluación de control con fines de calidad y cantidad y puede adoptarse para otras modificaciones de histonas o factores de transcripción.

Video: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Investigación

Biología

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Lote de inmunotinción para la detección de proteínas a gran escala en el cerebro del mono entero

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

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Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

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A gran escala basado en pez cebra En vivo Pantalla de moléculas pequeñas

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Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Ensayo Infinium para aplicaciones a gran escala de genotipado de SNP

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Una estrategia para sensibles, grande escala cuantitativa Metabolómica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

La automatización de experimentos-chip siguientes para generar perfiles epigenéticos en 10.000 células HeLa

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...